p38MAPK基因沉默對(duì)唇裂術(shù)后瘢痕增生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過(guò)建立模擬人唇裂術(shù)后傷口愈合的兔上唇瘢痕模型，對(duì)此模型進(jìn)行術(shù)后瘢痕生長(zhǎng)的時(shí)間序列研究以明確兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕增生最嚴(yán)重程度所在時(shí)間。通過(guò)構(gòu)建p38MAPK基因沉默重組腺病毒干擾靶基因的表達(dá)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)P38MAPK信號(hào)通路受阻后對(duì)兔模型上唇瘢痕的影響效果來(lái)尋找基因治療瘢痕的最佳時(shí)間以及探討Smad信號(hào)通路與p38MAPK之間的cross-talk(交叉對(duì)話）情況。從整體水平闡明腺病毒介導(dǎo)的p38MAPK基因沉默對(duì)兔上唇瘢痕模

2、型的治療性作用的分子機(jī)制。為開拓對(duì)我國(guó)唇裂術(shù)后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.運(yùn)用Millard's單側(cè)唇裂修復(fù)法完成兔上唇瘢痕模型的構(gòu)建。
　　2.分別在術(shù)后2、3、4、5周測(cè)量瘢痕體積并進(jìn)行肌成纖維細(xì)胞（MFB)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和Western blot定性和定量檢測(cè)兔上唇瘢痕組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA)的含量。
　　3.篩選p38MAPK基因沉默最有效sh

3、RNA序列及構(gòu)建腺病毒載體。
　　4.術(shù)后0周、1周、2周分別進(jìn)行瘢痕組織P38MAPK基因沉默腺病毒轉(zhuǎn)染，然后在術(shù)后3周獲取標(biāo)本，用四種方法（天狼猩紅染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot、Real-time PCR)分別定性、定量檢測(cè)p38MAPK及瘢痕形成相關(guān)因子（coll、colIII、MMP1、TIMP1)的蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。
　　5.Y周時(shí)，用Western blot和Real-time P

4、CR檢測(cè) Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、p38MAPK及p-p38MAPK的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕模型。
　　2.瘢痕體積和MFB細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，術(shù)后2周與術(shù)后5周，術(shù)后3周與術(shù)后4周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05),術(shù)后2周與術(shù)后3周及4周均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異iP＜0.01)。免疫組化染色結(jié)果顯示：術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA表達(dá)明顯多于術(shù)后2周

5、、5周。Western blot結(jié)果顯不：術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA蛋白表達(dá)較術(shù)后2周、5周增強(qiáng)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　3.成功篩選出p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列并構(gòu)建了腺病毒載體。
　　4.局部注射腺病毒后，天狼猩紅染色結(jié)果示：術(shù)后1周瘢痕組織中colIII表達(dá)明顯多于術(shù)后0周及2周，術(shù)后1周瘢痕組織中coll表達(dá)明顯少于術(shù)后0周及2周。免疫組化染色結(jié)果顯亦：術(shù)后1周療痕組織中co

6、lIII、MMP1表達(dá)明顯多于術(shù)后0周及2周，術(shù)后1周瘢痕組織中coll、TIMP1表達(dá)明顯少于術(shù)后0周及2周。Western blot結(jié)果顯不：術(shù)后1周瘦痕組織中colIII及MMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達(dá)增強(qiáng)，術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAPK、coll及TIMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達(dá)減弱。Real-time PCR結(jié)果示：術(shù)后1周瘢痕組織中colIII及MMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周升高，術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAP

7、K、coll及TIMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周降低。
　　5.術(shù)后1周注射腺病毒，Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，術(shù)后1周瘢痕組織中p-Smad2、p-Smad3及p-p38MAPK蛋白表達(dá)降低。Real-time PCR結(jié)果不：術(shù)后1周瘢痕組織中Smad2、Smad3及p38MAPK的mRNA水平較對(duì)照組降低。
　　結(jié)論:為研究基因治療唇裂術(shù)后瘢痕增生提供了兔上唇瘢痕模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可得術(shù)后3周及4周