Tap2b基因轉染NIH3T3細胞及其對P38MAPK信號通路的影響.pdf

1、肺癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，不管是發(fā)病率還是死亡率均位居惡性疾病前列，它的發(fā)生是多基因、多因素、多階段相互作用的結果。參與肺癌發(fā)生過程的相關基因在正常組織和肺癌中的表達存在顯著的差異，發(fā)現(xiàn)和研究這些肺癌差異表達基因不但有利于揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，而且還可為肺癌的診斷、治療以及預防提供新的生物標志和靶點。
　　 Rap2b基因是最近運用抑制性消減雜交技術從中國人肺鱗癌高表達文庫中篩選出的一個基因，它是ras癌基因超家族

2、中的一員，并與之高度同源。以往研究顯示多種腫瘤都存在ras的突變及過度表達。Ras基因影響下游效應因子多數(shù)是通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉導系統(tǒng)，P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)是MAPK家族成員之一。因此，rap2b基因也可能在P38MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用。目的

3、　　 該研究通過把pcDNA3.1-rap2b重組質粒轉染NIH3T3細胞，并應用P38MAPK特異性抑制劑，以觀察P38MAPK通路下游轉錄因子ATF-2的活化情況和rap2b基因在該通路中的作用，為探討rap2b基因在人肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。實驗方法
　　 1.pcDNA3.1-rap2b重組質粒及pcDNA3.1空質粒的提取用質粒提取試劑盒分別提取pcDNA3.1-rap2b重組質粒及pcDNA3.1空質粒，

4、并進行初步鑒定。
　　 2.重組質粒的酶切鑒定對pcDNA3.1-rap2b重組質粒分別進行EcoR I單酶切和EcoR I、Xho I雙酶切鑒定，1.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
　　 3.PCR方法擴增rap2b基因以提取的質粒為模板，利用rap2b基因的上下游特異性引物進行PCR擴增，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行鑒定，觀察有無rap2b基因目的片段。
　　 4.重組質粒的測序鑒定
　　 經

5、北京三博生物工程技術公司采用pcDNA3.1通用引物測定。運用BLAST軟件，將rap2b基因序列與Genebank公布的對應序列進行比較分析。
　　 5.轉染NIH3T3細胞將鑒定后去內毒素的質粒轉染NIH3T3細胞中，48h和72h后分別從核酸和蛋白方面進行鑒定。
　　 6.P38MAPK抑制劑的應用轉染前1h用P38MAPK抑制劑處理轉染細胞，72h后從蛋白方面進行鑒定。
　　 7.Western-blot

6、以正常細胞組作為對照，對轉染空質粒細胞組、轉染重組質粒細胞組、抑制劑+重組質粒細胞組測定磷酸化的和總的ATF-2蛋白表達，以了解rap2b基因在P38MAPK通路中所起的作用。
　　 結果：
　　 1.pcDNA3.1-rap2b重組質粒的提取與鑒定
　　 挑取單菌落振蕩過夜培養(yǎng)后提取質粒，進行鑒定。結果顯示，EcoRI單酶切產物長度為5.5kb左右，EcoRI及XhoI雙酶切產物長度分別是5.5kb和0.629

7、kb，和預期結果相同。用陽性質粒作為模板，用rap2b基因的特異上下游引物進行PCR擴增，擴增出大小為629bp的片段。經測序和序列分析，與Genebank公布的對應序列同源性為100％，證明是pcDNA3.1-rap2b重組質粒。
　　 2.轉染NIH3T3細胞結果
　　 從細菌中提取去內毒素的質粒，用脂質體法將其轉染進NIH3T3細胞中，通過RT-PCR進行mRNA的鑒定，擴增的目的條帶與預期結果一致；提取蛋白后檢測

8、，轉染pcDNA3.1-rap2b質粒的細胞表達RAP2B蛋白，轉染pcDNA3.1質粒和空白對照組則沒有表達。
　　 3.Western-blot結果
　　 對于ATF-2磷酸化蛋白表達，與正常細胞和轉染pcDNA3.1空質粒細胞相比，轉染pcDNA3.1-rap2b重組質粒的細胞表達上調（P＜0.05），與轉染pcDNA3.1-rap2b重組質粒的細胞相比，轉染抑制劑+pcDNA3.1-rap2b重組質粒的細胞表達下