應(yīng)激刺激誘導(dǎo)p38MAPK核移位的分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞信號(hào)特異性傳遞過程取決于信號(hào)發(fā)生和傳遞的時(shí)間和空間特征。信號(hào)蛋白的亞細(xì)胞定位和激活后移位是信號(hào)傳遞的主要空間特征。在許多情況下，信號(hào)蛋白需要錨定于適配體蛋白、細(xì)胞骨架及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，或與其上游激酶和下游底物結(jié)合來發(fā)揮正常功能。信號(hào)分子的特異性定位有助于細(xì)胞高效經(jīng)濟(jì)地完成各種正常功能和病理反應(yīng)。因此，蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位研究已成為目前國(guó)際上細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究最重要的內(nèi)容之一。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信

2、號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，普遍存在于包括酵母和哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物。MAPK家族包括ERK、JNK、p38和ERK5/BMK1四個(gè)亞家族。MAPK的底物包括轉(zhuǎn)錄因子、胞內(nèi)蛋白激酶、骨架相關(guān)蛋白、離子通道蛋白等。MAPK家族成員在細(xì)胞中都具有特定的定位，且觀察到在適宜的刺激下，多個(gè)MAPK家族成員移位入核的現(xiàn)象。MAPK的細(xì)胞內(nèi)定位和激活后移位，以及對(duì)上游激酶和下游底物的選擇性作用是激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制。
　　

3、 p38信號(hào)通路主要在炎癥和應(yīng)激反應(yīng)中起作用。致炎細(xì)胞因子、細(xì)菌成份、紫外線照射、細(xì)胞外高滲、H2O2和熱休克等刺激都能激活p38通路。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，p38在細(xì)胞中彌散分布，且在LPS刺激后能迅速移位入核并誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)。然而，這種核移位是一個(gè)短暫的過程，在信號(hào)被滅活后p38將重新分布于胞質(zhì)中。當(dāng)阻斷p38的移位時(shí)，信號(hào)的傳導(dǎo)也將被阻斷，這表明正常的p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)需要通過其移位來完成。
　　 盡管對(duì)于p38的細(xì)胞內(nèi)

4、定位情況和激活后移位已有一些報(bào)道，然而由于實(shí)驗(yàn)方法的差異和技術(shù)手段的限制，不同研究者對(duì)于p38定位與移位機(jī)制的研究結(jié)果大相徑庭。多種因素都可能參與p38定位與移位的調(diào)節(jié)。在某種疾病狀態(tài)或刺激作用下，對(duì)于特定的細(xì)胞類型，哪種機(jī)制參與調(diào)節(jié)這一過程，尚未闡明。
　　 因此，在文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作的基礎(chǔ)上，我們擬研究不同刺激性質(zhì)和時(shí)間以及在不同細(xì)胞系中p38的細(xì)胞內(nèi)定位情況，p38的磷酸化和激酶活性以及其上游激酶MKK6、下游

5、底物MK2和PRAK對(duì)其細(xì)胞內(nèi)定位的影響；研究對(duì)微管、微絲或馬達(dá)蛋白的干預(yù)對(duì)p38細(xì)胞內(nèi)定位的影響；以及利用出核抑制劑和入核抑制劑來分別觀察對(duì)p38出、入核的影響。
　　 我們首先驗(yàn)證了p38在受到應(yīng)激刺激后能被顯著磷酸化并移位入核，隨后用多種不同刺激條件，包括UV、anisomycin、LPS、H2O2、sobitol對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)都有p38移位入核現(xiàn)象的發(fā)生，說明各種能夠活化p38 MAPK的應(yīng)激刺激均可以使p38核移

6、位。而且，多種細(xì)胞系中都可觀察到p38受到刺激后的移位現(xiàn)象，這些結(jié)果說明了p38激活后的核移位在真核動(dòng)物細(xì)胞中是一個(gè)普遍現(xiàn)象。
　　 我們還觀察了p38核移位過程的時(shí)間點(diǎn)。在細(xì)胞受到短暫的應(yīng)激刺激后，p38被磷酸化并逐漸轉(zhuǎn)移至胞核，在60 min左右達(dá)到高峰，之后逐漸出核，在240 min時(shí)回到靜息水平。倘若刺激因素持續(xù)作用于細(xì)胞，則p38磷酸化水平持續(xù)增加并始終聚集在核內(nèi)而不出核。這提示p38的入核依賴于磷酸化而出核依賴于去磷

7、酸化。
　　 利用p38不同突變體進(jìn)行的研究表明，p38(AF)的胞內(nèi)定位在刺激后不發(fā)生改變，失去了移位入核的能力，而p38(KM)不受影響，說明p38在刺激后的核移位確實(shí)是磷酸化依賴的，而且不依賴于其激酶活性。利用不同MAPK通路抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，對(duì)p38的移位入核都沒有阻斷作用，這再次證實(shí)了p38的移位入核與其自身的激酶活性沒有關(guān)系。
　　 隨后我們進(jìn)一步探討了p38上游激酶和下游底物對(duì)其細(xì)胞內(nèi)定位的影響。結(jié)果表明

8、，p38的移位入核不但依賴于MKK6對(duì)其的磷酸化，而且MKK6的細(xì)胞內(nèi)定位還能影響p38在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。p38下游底物MK2的定位可以決定p38的細(xì)胞內(nèi)定位，可能是作為p38的錨定蛋白發(fā)揮作用。p38另一個(gè)下游底物PRAK對(duì)p38核移位的影響與MK2類似。這些結(jié)果說明p38在應(yīng)激刺激后的移位還與其上游激酶、下游底物的細(xì)胞內(nèi)定位都有著密切的關(guān)系。
　　 我們的前期研究提示細(xì)胞骨架可能參與了p38移位入核這個(gè)迅速而有序的過程。我

9、們利用不同的細(xì)胞骨架相關(guān)功能抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用微管破壞劑nocodazole預(yù)處理細(xì)胞后，p38的移位入核被阻斷，說明p38的激活和移位入核都需要功能正常的微管系統(tǒng)，而微絲系統(tǒng)沒有明顯作用。而且，p38的激活后移位與動(dòng)力蛋白相關(guān)而且是能量依賴性的，而與肌球蛋白沒有明顯關(guān)系。
　　 我們分別觀察了典型的入核抑制劑WGA和出核抑制劑LMB對(duì)p38出、入核的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分別用WGA或LMB預(yù)處理后，并不能阻斷

10、p38的入核或出核。
　　 總之，我們利用定點(diǎn)突變、熒光蛋白報(bào)告基因和免疫熒光等技術(shù)研究了應(yīng)激刺激時(shí)p38的細(xì)胞內(nèi)定位和激活后移位的影響因素，得到了如下結(jié)論：
　　 1)不同類型的刺激都可引起p38的激活后移位；p38的激活后移位廣泛存在于不同細(xì)胞系中；p38受到刺激后60min移位達(dá)到高峰，隨后又逐漸回到靜息水平；
　　 2)p38的激活后移位由其磷酸化決定，而與其激酶活性無關(guān)；
　　 3)p38的上游

11、激酶MKK6、下游底物MK2和PRAK都能影響p38細(xì)胞內(nèi)定位；
　　 4)干預(yù)微管和動(dòng)力蛋白以及抑制能量供應(yīng)可阻斷p38的激活后移位，而干預(yù)微絲和肌球蛋白沒有影響；
　　 5)p38的出核依賴于去磷酸化；
　　 6)出核抑制劑LMB和入核抑制劑WGA對(duì)p38的出、入核沒有影響。
　　 綜上所述，我們通過研究證實(shí)了p38在應(yīng)激刺激下的核移位是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡且取決于其自身磷酸化狀態(tài)的能量依賴過程，微管系統(tǒng)和動(dòng)