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文檔簡介
1、目的:
本研究旨在探討p38 MAPK4亞基(即p38α,p38β,p38γ和p38δ)在食管鱗癌細胞惡性行為中的作用,探討p38α,p38β,p38γ和p38δ表達的臨床病理學意義;在細胞水平分析p38α,p38β,p38γ和p38δ在細胞增殖,遷移,浸潤,周期和凋亡中的作用;同時,構建p38γ和p38δ慢病毒干擾及過表達載體,流式細胞儀分選陽性細胞,皮下注射裸小鼠構建皮下荷瘤動物模型,觀察p38γ和p38δ在體內(nèi)成瘤中的作
2、用。
方法:
運用免疫組織化學技術在食管鱗癌的組織芯片上檢測p38β,p38γ和p38δ的表達水平,運用卡方統(tǒng)計學分析方法分析p38β,p38γ和p38δ表達的臨床病理學意義(包括患者年齡,性別,臨床分期,T分期,N分期,分化程度,腫瘤大小及大類型);同時,運用Kaplan-Meier生存曲線分析p38β,p38γ和p38δ表達水平與患者的總預后的統(tǒng)計學相關性。在體外食管癌細胞系Eca109中,針對p38α,p38β
3、,p38γ和p38δ的cDNA序列,我們分別構建了短發(fā)夾RNA干擾載體(shRNA)和真核過表達載體, Lipofectamine2,000轉(zhuǎn)染Eca109細胞;運用western-blot檢測所構建干擾或過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果;運用細胞劃痕實驗檢測p38α,p38β,p38γ和p38δ干擾或過表達后食管癌細胞Eca109的遷移變化;運用Transwell實驗檢測p38α,p38β,p38γ和p38δ干擾或過表達后食管癌細胞Eca109的
4、浸潤變化;運用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化。最后針對研究相對較少的p38γ和p38δ,我們分別構建了其慢病毒干擾和過表達載體,轉(zhuǎn)染Eca109細胞,建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p38γ穩(wěn)定敲低和p38δ過表達的Eca109細胞系,并用流式細胞儀進行分選出陽性細胞。最后將流式細胞儀分選出陽性細胞,擴大培養(yǎng),并且皮下注射裸小鼠,構建Eca109細胞皮下荷瘤小鼠模型,觀察p38γ和p38δ基因在體內(nèi)對腫瘤細胞增殖的影響。
結(jié)果:
5、第一部分:相比癌旁正常組織,p38α在食管癌組織中顯著性高表達(P=0.000);其表達水平與臨床病理學參數(shù),如:年齡(P=0.436),性別(P=1.000),臨床分期(P=0.514),T分期(P=0.429),N分期(P=0.646),分化程度(P=0.670),腫瘤大?。≒=0.610)和大體類型(P=0.551)均不具有統(tǒng)計學相關性,與患者的總預后也不具有統(tǒng)計學相關性(P>0.05);相比癌旁正常組織,p38β在食管癌組織中顯
6、著性高表達,其差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);且p38β表達與腫瘤大小具有統(tǒng)計學相關性(P=0.044)。但與其他臨床病理學參數(shù),如,性別(P=0.730),年齡(P=0.294),臨床分期(P=0.118),T分期(P=0.692),N分期(P=0.109),分化程度(P=0.470)和大體類型(P=0.609)均不具有統(tǒng)計學相關性;p38γ在癌和癌旁組織中表達不具有統(tǒng)計學相關性(P=0.365),與性別(P=1.000),年齡
7、(P=0.609),T分期(P=0.063),分化程度(P=0.0.093)和大體類型(P=0.315)等參數(shù)均無統(tǒng)計學相關性,但是與臨床分期(P=0.017),N分期(P=0.008),腫瘤大?。≒=0.017)具有統(tǒng)計學相關性;相比癌旁正常組織,p38δ在食管癌組織中顯著性高表達,其差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);但是p38δ的表達與其他臨床病理學參數(shù),如性別(P=1.000),年齡(P=0.603),臨床分期(P=0.089
8、),T分期(P=0.646),N分期(P=0.568),分化程度(P=0.791)和大體類型(P=0.575)均不具有統(tǒng)計學相關性。運用Kaplan-Meier生存曲線分析p38β的表達與食管癌患者的總預后具有統(tǒng)計學相關性(P=0.012),p38γ和p38δ的表達與患者總預后均無統(tǒng)計學相關性(P=0.667和P=0.364)。
第二部分:在體外食管癌細胞系水平,我們發(fā)現(xiàn)干擾p38α,p38β,p38γ和p38δ亞基后,相比對
9、照組p38α能夠顯著性地促進Eca109的增殖,遷移和浸潤;但是干擾p38β,p38γ和p38δ亞基后能夠顯著性地抑制Eca109的增殖,遷移和浸潤。轉(zhuǎn)染真核過表達質(zhì)粒后,表型則相反。流式細胞分析結(jié)果顯示,相比對照組,干擾p38α后能夠抑制能夠顯著性地抑制Eca109的凋亡,周期S期顯著性增加;干擾p38β,p38γ和p38δ亞基后能夠抑制能夠顯著性地促進Eca109的凋亡,周期S期顯著性降低;轉(zhuǎn)染真核過表達質(zhì)粒后,凋亡和周期表型則相反
10、。
第三部分:皮下荷瘤小鼠模型結(jié)果顯示,與對照組相比,p38δ亞基過表達后,在裸鼠皮下能夠顯著性的促進腫瘤生長;與對照組相比,而p38γ敲低后,在裸鼠皮下能夠顯著性的抑制腫瘤生長。提示p38γ和p38δ亞基均能促進體內(nèi)食管癌細胞Eca109細胞的增殖。
結(jié)論:
?。?)在臨床組織水平除了p38γ亞基在食管癌和癌旁組織中表達沒有統(tǒng)計學差異外,其余三個亞基,即p38α,p38β和p38δ亞基均在食管癌組織中顯著性
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