DBZ和IDHP對低氧刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　各種肺內(nèi)外因素造成的低氧刺激均能影響血管內(nèi)膜、血管中層和血管外膜，并導致肺組織血管的病理改變和結(jié)構(gòu)重塑，最終引起肺循環(huán)負荷的增加和肺動脈高壓。肺動脈內(nèi)皮細胞襯于肺動脈的最內(nèi)層，直接與血液接觸并感應(yīng)血流、血壓、氧含量和血液中各種因子的變化。目前認可程度較高的一種假說認為，肺動脈內(nèi)皮細胞損傷是肺動脈高壓形成的始動環(huán)節(jié)。因此，研究低氧對血管內(nèi)皮細胞的損傷機制并尋找可靠的保護措施對低氧肺動脈高壓防治具有特殊的意義。

2、　　中醫(yī)理論認為丹參具有活血化瘀、理氣止痛的功效，臨床應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療。丹參素是中藥丹參根莖中的主要水溶性生物活性成分，丹參素冰片酯（Tanshinol borneol ester，DBZ）是按照中醫(yī)“君使”理論以丹參素和冰片酯化合成的丹參素衍生物；而丹參素異丙酯（IDHP）是利用代謝組學方法在復方丹參方(Salvia miltiorrhiza bunge)中發(fā)現(xiàn)的核心效應(yīng)成分；更為重要的是，DBZ和IDHP都是正在研究

3、的臨床前藥物。因此，明確DBZ和IDHP對低氧刺激的血管內(nèi)皮細胞是否具有保護作用并探索其保護作用的機制，對于完善丹參素及其衍生物心血管保護理論和開發(fā)新型心血管保護藥物具有指導意義。
　　研究目的：
　?。?）探討低氧刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化應(yīng)激、細胞自噬和凋亡的影響及機制；
　?。?）探討DBZ和IDHP對低氧刺激時HUVEC細胞氧化應(yīng)激、細胞自噬和凋亡的保護作用及機制；
　?。?）對比不同構(gòu)型的

4、DBZ和IDHP對低氧刺激時HUVEC細胞的保護作用差異，明確保護作用最佳的藥物構(gòu)型。
　　研究意義：
　　本課題明確了低氧刺激造成 HUVEC細胞氧化應(yīng)激，進一步引起細胞自噬和細胞凋亡的發(fā)展變化規(guī)律及其相互作用關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，我們進一步明確了DBZ和IDHP對低氧刺激時HUVEC細胞氧化應(yīng)激、自噬和凋亡的保護作用，并明確干預(yù)效果最佳的藥物構(gòu)型。
　　實驗方法：
　　(1)單純低氧刺激實驗分組：
　　對數(shù)

5、生長期的細胞隨機分為空白對照組、低氧刺激12 h、24 h、48 h或72 h組，低氧處理的細胞在含有1％氧氣的條件下培養(yǎng)相應(yīng)的時間后收集細胞培養(yǎng)液上清檢測T-SOD活性和MDA含量；收集細胞并提取蛋白檢測細胞中Trx-1、Txnip、Nrf2、Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、HIF-1α、BNIP3、BNIP3L、Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達。采用流式細胞技術(shù)的方法檢測細胞中ROS含量的變

6、化、細胞周期分布和細胞凋亡情況；采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測細胞中自噬體的生成量；采用JC-1探針檢測細胞檢測低氧刺激HUVEC細胞線粒體膜電位變化。
　　(2)低氧刺激并進行藥物干預(yù)的實驗分組
　　對數(shù)生長期的細胞隨機分為空白對照組（Control）、低氧刺激24 h組（Hypoxia組）、低氧刺激+不同構(gòu)型 DBZ/IDHP組（Hypoxia+DBZ/IDHP組）、單純不同構(gòu)型DBZ/IDHP干預(yù)組（DBZ/

7、IDHP組）；培養(yǎng)細胞24小時后，收集細胞培養(yǎng)液上清檢測T-SOD活性和MDA含量；收集細胞并提取蛋白檢測細胞中Trx-1、Txnip、Nrf2蛋白表達。
　　(3) HIF-1α siRNA對細胞自噬影響的研究實驗分組
　　在HIF-1α siRNA干預(yù)HUVEC細胞的實驗中，我們將細胞在有或無HIF-1αsiRNA干預(yù)的情況下分為：空白對照組（Control），低氧刺激24 h、48 h和72 h組， HIF-1α si

8、RNA干預(yù)對照組和HIF-1α siRNA聯(lián)合低氧刺激24 h、48 h和72 h組；并在低氧刺激細胞相應(yīng)時間后，采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測細胞中自噬體的生成量；并提取細胞蛋白檢測Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表達量。另外，在低氧刺激細胞相應(yīng)時間后，采用流式細胞技術(shù)的方法檢測細胞凋亡情況。
　　(4)3-MA或雷帕霉素干預(yù)對細胞凋亡影響

9、的研究實驗分組
　　將正常培養(yǎng)的細胞和3-MA或雷帕霉素預(yù)處理的細胞分別隨機分為：空白對照組、低氧（24h、48h、72h）處理組；并在低氧刺激細胞相應(yīng)時間后，采用LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測細胞中自噬體的生成量；并提取細胞蛋白檢測Beclin-1、LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表達量。并在低氧刺激細胞相應(yīng)時間后，采用流式細胞技術(shù)的方法檢測細胞凋亡情況。

10、>　　(5)不同構(gòu)型的DBZ和IDHP對低氧刺激時HUVEC細胞自噬的影響
　　對數(shù)生長期的細胞隨機分為如下幾組：空白對照、單純低氧刺激組、低氧刺激+左旋體（S）藥物組、低氧刺激+右旋體（R）藥物組、低氧刺激+消旋體藥物組，以及三種構(gòu)型藥物的對照組。所有低氧刺激的細胞均在氧含量為1%的環(huán)境中培養(yǎng)24小時，而后采用 LC-3B-GFP熒光染色的方法檢測細胞中自噬體的生成；并提取細胞蛋白檢測Beclin-1、LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ的表

11、達量。在氧含量為1%的環(huán)境中培養(yǎng)72小時，而后采用流式細胞技術(shù)的方法檢測細胞凋亡情況；采用western blot法檢測細胞中Cyto-C、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2等蛋白的表達。
　　實驗結(jié)果：
　　（1）含氧為1%的環(huán)境中培養(yǎng)HUVEC細胞后細胞中MDA和ROS含量增加，T-SOD活性降低；同時伴有Trx-1、Nrf2蛋白表達的降低和Txnip蛋白表達的增加；并且，上述變化均表現(xiàn)出明顯的時間依

12、賴性。左旋、右旋和消旋體的DBZ及IDHP均能夠促進 Trx-1和 Nrf2的表達，抑制 Txnip蛋白的表達，最終降低低氧刺激24小時后HUVEC細胞中MDA的含量并增加T-SOD的活性。
　　（2）低氧刺激時HUVEC細胞中自噬體熒光強度增加，Beclin-1和LC-3Ⅱ蛋白表達量及C-3Ⅱ與LC-3Ⅰ表達量的比值都在低氧刺激24小時達到最高；另外，低氧刺激時間依賴性地增加HUVEC細胞中HIF-1α、BNIP3和BNIP3L

13、的蛋白表達。HIF-1αsiRNA及3-MA干預(yù)能夠抑制低氧刺激時 HUVEC細胞中自噬體的生成和 Beclin-1及LC-3Ⅱ蛋白的表達，同時抑制LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ表達量比值的增加，說明HIF-1αsiRNA和3-MA能夠在一定程度上抑制低氧刺激引起的細胞自噬。不同構(gòu)型的DBZ和 IDHP都能夠促進低氧刺激24小時后 HUVEC細胞中自噬體的生成，同時增加Beclin-1和LC-3Ⅱ蛋白，以及LC-3Ⅱ和LC-3Ⅰ表達量的比值。本

14、部分結(jié)果還提示，左旋體DBZ和IDHP對低氧刺激時HUVEC細胞自噬的促進作用最為強烈，右旋體次之，消旋體藥物的促進作用最弱。3-MA預(yù)處理能夠在一定程度上抑制不同構(gòu)型DBZ和IDHP的上述作用。
　?。?）低氧刺激引起HUVEC細胞周期阻滯，在低氧刺激的前24小時表現(xiàn)為G2/M期阻滯，低氧刺激72小時表現(xiàn)為G0期阻滯；低氧刺激引起細胞凋亡，且隨著低氧刺激時間的延長細胞凋亡數(shù)量增加；并且，線粒體膜電位和Cyto-C、cleaved

15、 caspase-3、Bax和 Bcl-2等蛋白檢測結(jié)果表明低氧刺激通過線粒體相關(guān)途徑引起細胞凋亡。HIF-1α siRNA干預(yù)能夠減少低氧刺激時HUVEC細胞凋亡的數(shù)量，減少低氧刺激時Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax等促凋亡蛋白的表達，同時增加Bcl-2等抑制細胞凋亡蛋白的表達；相反，3-MA干預(yù)后增加低氧刺激時HUVEC細胞凋亡的數(shù)量，同時促進低氧刺激時低氧刺激時Cyto-C、cleaved caspase-

16、3和Bax等蛋白的表達，并抑制Bcl-2蛋白的表達；然而，雷帕霉素則能夠通過促進細胞自噬發(fā)揮與3-MA相反的作用。不同構(gòu)型的DBZ和IDHP都能夠減少低氧刺激72小時后HUVEC細胞的凋亡，同時Cyto-C、cleaved caspase-3和Bax等促凋亡蛋白的表達，并增加Bcl-2等抑制細胞凋亡蛋白的表達。更為重要的是，本部分結(jié)果還提示，左旋體DBZ和IDHP對低氧刺激時 HUVEC細胞凋亡的抑制作用最為強烈，右旋體次之，消旋體藥物