低氧預(yù)刺激對大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、研究背景及目的 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是胚胎發(fā)育早期參與血管發(fā)生(Vasculogenesis)的最重要的干細(xì)胞,近年研究發(fā)現(xiàn)成人骨髓和外周血中也存在少量EPCs.由于EPCs具有活躍的分化增生能力和不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的成血管能力,因此可作為干細(xì)胞移植促血管新生治療的一種理想的細(xì)胞供體,尤其對于老年、糖尿病、高脂血癥等由于ECs功能受損而對細(xì)胞/生長因子反應(yīng)低下的患者而言,其治療價值更為突出.但EPCs移植是一種個體化治療,

2、細(xì)胞來源較少,即使通過體外培養(yǎng)擴增獲得的數(shù)量亦有限,因此通過體外干預(yù)方法促進(jìn)EPCs的生物學(xué)活性是提高其治療效能的關(guān)鍵手段.既往研究表明低氧環(huán)境可誘導(dǎo)多種細(xì)胞系VEGF和VEGF受體(VEGFR)表達(dá)上調(diào),激活ECs的成血管功能,促進(jìn)局部血管生成,但低氧對于EPCs是否有類似的作用鮮有報道.該實驗旨在觀察低氧條件對大鼠骨髓源性EPCs的增殖、移行、旁分泌及成血管能力等生物學(xué)活性的影響,并探討其可能的機制,為臨床應(yīng)用EPCs移植前的低氧預(yù)

3、刺激及其療效評價提供理論依據(jù).實驗方法(1)采取大鼠骨髓,以密度梯度離心分離單個核細(xì)胞(MNCs),于體外培養(yǎng)并由牛垂體提取物(PEX)誘導(dǎo)擴增,經(jīng)DiI標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和異硫氰酸鹽熒光素標(biāo)記的單葉豆凝集素(FITC-BS-Lectin)雙染陽性鑒定為EPCs.(2)低氧條件采用三氣培養(yǎng)箱,控制氧濃度在2％,持續(xù)培養(yǎng)7天,觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化.(3)EPCs增殖活性采用細(xì)胞計數(shù)法測定細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞倍增時

4、間.(4)EPCs的遷移能力通過Under-Agarose模型誘導(dǎo)趨化,分別用顯微鏡測定遷移細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞平均遷移距離.(5)EPCs的旁分泌功能測定采用EPCs條件培養(yǎng)液刺激ECs,并用BrdU法測定ECs核DNA復(fù)制.(6)EPCs的成血管能力測定采用Ⅰ型膠原凝膠系統(tǒng),光鏡下觀察EPCs形成管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目.(7)VEGF和Flk-1 mRNA表達(dá)測定采用半定量RT-PCR法.(8)Western Blot法測定絲裂原激活蛋白激酶ER