糖尿病大鼠外周血和骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞體外生物學(xué)活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：EPC已經(jīng)成功地從骨髓和外周血中得到分離。近年來研究表明EPC可作為內(nèi)皮損傷修復(fù)的另一個(gè)細(xì)胞來源，EPC在人和動(dòng)物模型已經(jīng)顯示能促進(jìn)血管新生和再內(nèi)皮化，表明它在維持內(nèi)皮完整性中有重要作用。然而EPC促進(jìn)血管新生的機(jī)制仍不清楚，可能與EPC直接參與新血管生成和分泌一些成血管的細(xì)胞因子促進(jìn)新血管生成有關(guān)。糖尿病通常受到心血管并發(fā)癥的困擾，包括外周血管疾病。在有外周血管疾病的患者，側(cè)支循環(huán)形成不能代償由于動(dòng)脈閉塞而導(dǎo)致的血流減少，這個(gè)問

2、題在側(cè)支循環(huán)形成低下的糖尿病患者更是如此，這將導(dǎo)致嚴(yán)重的肢體缺血性疼痛甚至截肢。由于EPC功能失調(diào)可能降低糖尿病患者的血管再生能力，因此有學(xué)者提出糖尿病的血管并發(fā)癥源于EPC功能失調(diào)的假說。認(rèn)為血管內(nèi)皮功能失調(diào)在糖尿病血管并發(fā)癥中有重要的作用。EPC雖然具有強(qiáng)大的增殖和分化成內(nèi)皮細(xì)胞的能力，但是糖尿病外周血EPC在增殖、黏附、遷移和血管結(jié)構(gòu)的參與能力上均缺陷。而EPC在糖尿病骨髓中的變化目前研究較少，是否也存在功能受損有待于進(jìn)一步研究。

3、因此，本實(shí)驗(yàn)推測糖尿病骨髓EPC數(shù)量和生物學(xué)活性也受到影響，并同時(shí)比較骨髓和外周血EPC的數(shù)量和生物學(xué)活性的差異。這對進(jìn)一步明確糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理有重要作用，并可能為糖尿病并發(fā)癥早期診斷、治療和判斷預(yù)后提供線索。為了證實(shí)我們的推測，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。 方法： 1．糖尿病動(dòng)物模型的建立：雄性SD大鼠35只，試驗(yàn)組25只，按50 mg/kg一次性腹腔快速注射1％的STZ液。對照組10只，注射等量的檸檬酸鈉．檸檬酸緩沖液。

4、注射14d后動(dòng)物血糖濃度>16.65 mmol/L判定為1型糖尿病動(dòng)物模型，取注射后14天的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 2．外周血和骨髓EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定：分別取大鼠外周血和骨髓，加PBS等倍稀釋并混勻。沿管壁緩慢加入裝有大鼠淋巴細(xì)胞分離液(1.083g/ml)的15ml離心管中。2000r/minx20min密度梯度離心后將中間的白霧層吸出并置入另一短中管中，加入5倍體積的M199，以1500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞兩次。末

5、次離心后，棄上清，加入M199重懸細(xì)胞。以1×106/mL的密度接種于預(yù)涂膠原的培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3-4d后換液，將未貼壁細(xì)胞棄之。在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察體外培養(yǎng)的EPC的形態(tài)、生長及增殖情況。胰酶消化培養(yǎng)7天的貼壁細(xì)胞試驗(yàn)。用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1檢測來鑒定EPC。 3．EPC體外功能的測定：收集培養(yǎng)七天的貼壁細(xì)胞作EPC

6、黏附能力測定；用改良的Boyden小室作EPC遷移能力測定；MTT法測定EPC增殖能力；用體外血管生成試劑盒作EPC體外血管生成能力的測定；用放射性免疫法測定細(xì)胞的培養(yǎng)液GM-CSF，EPO和IL-8的含量。 結(jié)果： 1．骨髓和外周血來源的EPC在體外培養(yǎng)時(shí)都呈梭形，貼壁生長，二者均表達(dá)CD34，CD133和VEGFR-2表達(dá)，且能結(jié)合UEA-Ⅰ并攝取ac-LDL，證明所培養(yǎng)細(xì)胞為EPC。 2．EPC數(shù)量測定發(fā)現(xiàn)

7、糖尿病組骨髓和外周血的EPC數(shù)目比對照組明顯減少，并且對照組和糖尿病組大鼠外周血EPC數(shù)目都比骨髓EPC數(shù)目減少。 3．EPC體外功能測定表明糖尿病組大鼠外周血和骨髓EPC的黏附能力比對照組明顯減少；遷移能力降低：增殖能力減弱；體外血管生成能力降低；EPC分泌的IL-8，EPO和GM-CSF比對照組都減少。 4．大鼠外周血EPC遷移能力比骨髓EPC減弱；增殖能力降低；EPC分泌的IL-8和EPO也減少。而外周血EPC和骨