人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后細胞表型變化及生物學活性的研究.pdf

1、第一部分： 目的：建立一種高效、簡便的體外擴增培養(yǎng)人外周血淋巴細胞的方法。 方法：取35例惡性腫瘤患者的外周血單個核細胞(PBMCs)，在GMP實驗室體系下，應(yīng)用OKM-100及OKM-200培養(yǎng)基，經(jīng)細胞刺激因子OKM-24體外誘導擴增，觀察效應(yīng)細胞體外擴增培養(yǎng)周期、擴增前后細胞總數(shù)、擴增倍數(shù)以及細胞存活率，同時觀察細胞回輸患者后的不良反應(yīng)。 結(jié)果：細胞在培養(yǎng)的第2天即可觀察到效應(yīng)細胞增殖；細胞擴增培養(yǎng)周期為1

2、3.46±1.20d；擴增培養(yǎng)前外周血分離所得的PBMCs細胞數(shù)為6.60±2.23×106，擴增培養(yǎng)至細胞成熟收獲后所得的效應(yīng)細胞數(shù)為2.99±0.65×109，擴增倍數(shù)為488.06±191.25；臺盼藍染色檢測細胞存活率為97.71±1.07％；內(nèi)毒素及細菌、真菌、支原體、外來病毒檢測均為陰性?；颊呋剌斝?yīng)細胞后無明顯的不良反應(yīng)。 結(jié)論：在本研究體系下體外誘導擴增培養(yǎng)腫瘤患者自體外周血致敏淋巴細胞效率較高，操作簡便，生物安

3、全性良好。 第二部分人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后淋巴細胞表型變化研究 目的：觀察35例惡性腫瘤病人外周血淋巴細胞在體外經(jīng)擴增培養(yǎng)后細胞表型的變化。 方法：體外大規(guī)模誘導和擴增惡性腫瘤病人外周血淋巴細胞及單個核細胞，然后應(yīng)用流式細胞術(shù)測定擴增前后CD3+、CD19+、CD28+、CD25+、CD29+、CD45RA+、CD45RO+、HLA-DR+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+

4、、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD4+CD25+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+，CD3+HLA-DR+，CD3+HLA-DR-，CD4+HLA-DR+，CD4+HLA-DR+、CD4+HLA-

5、DR+、CD4+HLA-DR-細胞在淋巴細胞中所占百分比的變化。 結(jié)果：經(jīng)體外擴增培養(yǎng)后，CD3+，CD3+CD8+，CIK(cytokine-inducedkillercells)細胞及其亞型CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD3+CD16+CD56+，CD45RO+細胞及其亞型CD8+CD45RO+，CD8+CD28+，CD25+，CD29+，CD3+HLA-DR-，CD8+HLA-DR+和CD8

6、+HLA-DR-細胞比例較培養(yǎng)前明顯增加(P＜0.01)；而CD19+，CD3+CD4+，NK(naturalkillercells)細胞及其亞型CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+，CD45RA+細胞及其亞型CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD28+細胞及其亞型CD8+CD28+，CD4+CD25+，CD4+CD29+，CD4+HLA-DR+和

7、CD4+HLA-DR-細胞比例則明顯的降低(P＜0.01)；HLA-DR+細胞和CD3+HLA-DR+細胞培養(yǎng)前后細胞比例變化無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.137和0.423)。 結(jié)論：經(jīng)體外擴增培養(yǎng)后，所得細胞主要是以CD3+細胞為主，CD4+T細胞比例明顯下降，CD8+T細胞比例顯著增高，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)細胞和CD19+B細胞的比例極低，活化性T細胞的比例與培養(yǎng)前無顯著差異。在增多的CD8+T細胞中，效應(yīng)性T細胞(TE

8、)并未明顯增加，但記憶性T細胞(TM)卻顯著增多。NK細胞比例下降，但CIK細胞的比例卻明顯增多。從對培養(yǎng)后細胞表型的分析可知，理論上，培養(yǎng)后細胞不僅具有直接的殺傷腫瘤細胞的細胞毒活性，回輸患者體內(nèi)后經(jīng)抗原刺激后還具有活化為效應(yīng)細胞的能力。 第三部分人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后效應(yīng)細胞生物 方法：①按照本課題第一部分中的方法體外擴增3例惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞，收獲細胞后計算效應(yīng)細胞濃度，然后將效應(yīng)細胞分別放置于4℃

9、和25℃下保存，于細胞收獲后的不同時間點應(yīng)用碘化丙啶(PI)對兩種存放條件下的細胞進行染色并應(yīng)用流式細胞儀器檢測計算細胞存活率；②按照本課題第一部分中的方法體外擴增3例患者外周血淋巴細胞，按照本課題第二部分中的方法檢測擴增后細胞中NK細胞、CIK細胞的百分比，然后應(yīng)用MTT法檢測效應(yīng)細胞的細胞毒活性。 結(jié)果：①患者1效應(yīng)細胞初始存活率為98.8％，細胞濃度為7.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為102h

10、，而在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為48h；患者2效應(yīng)細胞初始存活率為95.5％，細胞濃度為5.8×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為60h，在25℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為24h；患者3效應(yīng)細胞初始存活率為97.1％，細胞濃度10.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為84h，在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為24h。②患者1效應(yīng)細胞中NK細胞的百分比為2.

11、4％，CIK細胞的百分比為53.9％，其12：1、25：1和50：1三個效靶比效應(yīng)細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷率分別為64.9％、70.8％和83.4％；患者2效應(yīng)細胞中NK細胞的百分比為0.6％，CIK細胞的百分比為69.5％，其12：1、25：1和50：1三個效靶比效應(yīng)細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷率分別為71.6％、75.1％和88.6％；患者3效應(yīng)細胞中NK細胞的百分比為11.6％，CIK細胞的百分比為41.7％，其12：1、25：1和50：