人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后細胞表型變化及生物學活性的研究.pdf

1、第一部分： 目的：建立一種高效、簡便的體外擴增培養(yǎng)人外周血淋巴細胞的方法。 方法：取35例惡性腫瘤患者的外周血單個核細胞(PBMCs)，在GMP實驗室體系下，應用OKM-100及OKM-200培養(yǎng)基，經細胞刺激因子OKM-24體外誘導擴增，觀察效應細胞體外擴增培養(yǎng)周期、擴增前后細胞總數(shù)、擴增倍數(shù)以及細胞存活率，同時觀察細胞回輸患者后的不良反應。 結果：細胞在培養(yǎng)的第2天即可觀察到效應細胞增殖；細胞擴增培養(yǎng)周期為1

2、3.46±1.20d；擴增培養(yǎng)前外周血分離所得的PBMCs細胞數(shù)為6.60±2.23×106，擴增培養(yǎng)至細胞成熟收獲后所得的效應細胞數(shù)為2.99±0.65×109，擴增倍數(shù)為488.06±191.25；臺盼藍染色檢測細胞存活率為97.71±1.07％；內毒素及細菌、真菌、支原體、外來病毒檢測均為陰性?；颊呋剌斝毎鬅o明顯的不良反應。 結論：在本研究體系下體外誘導擴增培養(yǎng)腫瘤患者自體外周血致敏淋巴細胞效率較高，操作簡便，生物安

3、全性良好。 第二部分人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后淋巴細胞表型變化研究 目的：觀察35例惡性腫瘤病人外周血淋巴細胞在體外經擴增培養(yǎng)后細胞表型的變化。 方法：體外大規(guī)模誘導和擴增惡性腫瘤病人外周血淋巴細胞及單個核細胞，然后應用流式細胞術測定擴增前后CD3+、CD19+、CD28+、CD25+、CD29+、CD45RA+、CD45RO+、HLA-DR+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16-CD56+

4、、CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD4+CD25+、CD4+CD29+、CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+，CD3+HLA-DR+，CD3+HLA-DR-，CD4+HLA-DR+，CD4+HLA-DR+、CD4+HLA-

5、DR+、CD4+HLA-DR-細胞在淋巴細胞中所占百分比的變化。 結果：經體外擴增培養(yǎng)后，CD3+，CD3+CD8+，CIK(cytokine-inducedkillercells)細胞及其亞型CD3+CD16-CD56+、CD3+CD16+CD56+、CD3+CD16+CD56+，CD45RO+細胞及其亞型CD8+CD45RO+，CD8+CD28+，CD25+，CD29+，CD3+HLA-DR-，CD8+HLA-DR+和CD8

6、+HLA-DR-細胞比例較培養(yǎng)前明顯增加(P＜0.01)；而CD19+，CD3+CD4+，NK(naturalkillercells)細胞及其亞型CD3-CD16-CD56+、CD3-CD16+CD56-、CD3-CD16+CD56+，CD45RA+細胞及其亞型CD4+CD45RA+、CD8+CD45RA+，CD4+CD45RO+，CD28+細胞及其亞型CD8+CD28+，CD4+CD25+，CD4+CD29+，CD4+HLA-DR+和

7、CD4+HLA-DR-細胞比例則明顯的降低(P＜0.01)；HLA-DR+細胞和CD3+HLA-DR+細胞培養(yǎng)前后細胞比例變化無統(tǒng)計學意義(P值分別為0.137和0.423)。 結論：經體外擴增培養(yǎng)后，所得細胞主要是以CD3+細胞為主，CD4+T細胞比例明顯下降，CD8+T細胞比例顯著增高，調節(jié)性T細胞(Treg)細胞和CD19+B細胞的比例極低，活化性T細胞的比例與培養(yǎng)前無顯著差異。在增多的CD8+T細胞中，效應性T細胞(TE

8、)并未明顯增加，但記憶性T細胞(TM)卻顯著增多。NK細胞比例下降，但CIK細胞的比例卻明顯增多。從對培養(yǎng)后細胞表型的分析可知，理論上，培養(yǎng)后細胞不僅具有直接的殺傷腫瘤細胞的細胞毒活性，回輸患者體內后經抗原刺激后還具有活化為效應細胞的能力。 第三部分人外周血淋巴細胞體外擴增培養(yǎng)后效應細胞生物 方法：①按照本課題第一部分中的方法體外擴增3例惡性腫瘤患者外周血淋巴細胞，收獲細胞后計算效應細胞濃度，然后將效應細胞分別放置于4℃

9、和25℃下保存，于細胞收獲后的不同時間點應用碘化丙啶(PI)對兩種存放條件下的細胞進行染色并應用流式細胞儀器檢測計算細胞存活率；②按照本課題第一部分中的方法體外擴增3例患者外周血淋巴細胞，按照本課題第二部分中的方法檢測擴增后細胞中NK細胞、CIK細胞的百分比，然后應用MTT法檢測效應細胞的細胞毒活性。 結果：①患者1效應細胞初始存活率為98.8％，細胞濃度為7.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為102h

10、，而在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為48h；患者2效應細胞初始存活率為95.5％，細胞濃度為5.8×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為60h，在25℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為24h；患者3效應細胞初始存活率為97.1％，細胞濃度10.4×107/mL，在4℃保存條件下其存活率明顯降低的時間點為84h，在25℃保存條件下其存活率明顯下降的時間點為24h。②患者1效應細胞中NK細胞的百分比為2.

11、4％，CIK細胞的百分比為53.9％，其12：1、25：1和50：1三個效靶比效應細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷率分別為64.9％、70.8％和83.4％；患者2效應細胞中NK細胞的百分比為0.6％，CIK細胞的百分比為69.5％，其12：1、25：1和50：1三個效靶比效應細胞殺傷腫瘤細胞的殺傷率分別為71.6％、75.1％和88.6％；患者3效應細胞中NK細胞的百分比為11.6％，CIK細胞的百分比為41.7％，其12：1、25：1和50：