低氧誘導因子-1α介導鼠胚成骨細胞血管內皮生長因子(VEGF)表達的實驗研究.pdf

1、目的：觀察低氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α，）在化學誘導的低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的原代鼠胚成骨細胞中的表達變化，并初步探討在低氧條件下HIF-1α，對成骨細胞VEGF表達的影響。 方法： 1．在無菌條件下取妊娠19天左右的KM胎鼠顱骨，進行原代鼠胚成骨細胞的培養(yǎng)，并用“反復貼壁法”對細胞進行純化，之后對傳代第3代培養(yǎng)的細胞持續(xù)計數(shù)8天，最后繪制細胞生長曲線，同時對已培養(yǎng)7天

2、的第4代細胞應用鈣-鈷染色法檢測細胞的堿性磷酸酶，進行成骨細胞鑒定。 2．取傳代第3代培養(yǎng)的成骨細胞，以含125umol/L終濃度氯化鈷的DMEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間，進行化學模擬缺氧狀態(tài)，對低氧培養(yǎng)的細胞在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并對細胞進行計數(shù)。將培養(yǎng)不同時間的成骨細胞分別設為0、1、3、5、7天缺氧組。同時，對常氧培養(yǎng)的第3代細胞設0、1、3、5、7天常氧組。 3．采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術

3、檢測低氧和常氧培養(yǎng)不同時間的成骨細胞HIF-1α和血管內皮生長因子（VEGF）m RNA的表達變化。 4．統(tǒng)計學處理：所有的實驗都重復三次，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 12．0軟件包進行單因素方差分析，以P<0．05判斷為有統(tǒng)計學差異。 結果： 1．經(jīng)組織塊法培養(yǎng)的成骨細胞，多呈梭形、三角形，有較多突起，部分細長突起?？缭郊毎c遠處的細胞突起相連接；胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側，輪廓清晰，可見1～3

4、個核仁。從接種后的第1天開始，倒置顯微鏡下觀察，細胞數(shù)量擴增較慢，為細胞生長適應期，以后細胞增長加速，第6天達到高峰，以后增長速度逐漸減慢，細胞數(shù)量開始下降。第4代培養(yǎng)的細胞堿性磷酸酶鈣-鈷染色結果顯示，細胞質內有黑色顆粒狀物質，有少量分散在細胞周圍。計數(shù)200個細胞，成骨細胞陽性率為95．5%，陽性細胞多為梭形和鱗片形細胞，符合成骨細胞的生物學特性。 2．經(jīng)氯化鈷處理后3天，細胞在形態(tài)學上可見細胞膜邊界不清，細胞皺縮，胞質致密

5、，核染色質邊集；氯化鈷處理后7天部分細胞出現(xiàn)凋亡。對氯化鈷處理后的細胞進行計數(shù)，可見細胞數(shù)量于第5天達到高峰，但遠低于同一時間的常氧組，之后細胞數(shù)量迅速降低。 3．反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各基因的表達變化：通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并經(jīng)Lab-work軟件分析可見，經(jīng)氯化鉆處理后，HIF-1α和VEGF mRNA的表達隨時間的延長逐漸增加（P<0．01），除第0天外，均高于常氧組（P<0．01），而常氧組各時間段則無明顯

6、變化（P>0．05）： 結論： 1：通過氯化鈷化學模擬低氧狀態(tài)，可以促使成骨細胞表達大量的HIF-1α。 2在低氧條件下，HIF-1α能夠誘導成骨細胞增強表達VEGF，從而可能加強局部血管形成，促進成骨細胞的分化，加速骨形成，促進骨創(chuàng)傷的修復。可能也為骨缺血，骨壞死，骨折等疾病的臨床VEGF基因治療提供初步理論探討。 3．改良的組織塊培養(yǎng)法結合了傳統(tǒng)的組織塊法和酶消化法的優(yōu)點，可在較短時間內獲得較多的成骨