間歇性低氧對(duì)氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能的影響及膽堿抗低氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：我國(guó)是世界上高原面積最大、海拔最高、居住人口最多的國(guó)家，海拔3000 m以上的高原、高山地區(qū)占我國(guó)國(guó)土總面積的1/4，主要分布在西藏、青海和新疆一帶。這些地區(qū)是國(guó)家實(shí)施西部大開發(fā)戰(zhàn)略的重要戰(zhàn)場(chǎng)，隨著青藏鐵路的開通、高原地區(qū)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和旅游事業(yè)的興旺，進(jìn)入高原的人群成倍增長(zhǎng)。高原地區(qū)的大氣壓、氧分壓、溫度、濕度等都不同于平原地區(qū)，這些因素的改變對(duì)機(jī)體造成的影響是廣泛的，包括對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面的影響。在這

2、些影響因素中低氧是最主要的影響因素，以往的研究多集中于高原低氧對(duì)急進(jìn)高原人群及久居高原人群身體機(jī)能的影響，而對(duì)于反復(fù)進(jìn)入高原后又返回平原，從事高原運(yùn)輸、高原旅游等人群的實(shí)驗(yàn)研究較少。間歇性低氧（IH）是指機(jī)體或組織間斷處于低氧環(huán)境。研究表明，間歇性低氧對(duì)機(jī)體組織的影響取決于低氧的程度、低氧的持續(xù)時(shí)間、以及低氧-常氧交替方式。膽堿，作為B族維生素中的一種重要的水溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在許多生理過(guò)程中如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成及保持細(xì)胞膜的完整性中起重要

3、作用。研究表明，低氧暴露可以改變膽堿代謝。但膽堿對(duì)低氧損傷的影響尚不清楚。
　　研究目的：本文擬從整體水平和細(xì)胞水平研究間歇低氧對(duì)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為高原疾病防治研究提供理論依據(jù)；觀察膽堿在血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧損傷中的作用，為進(jìn)一步探究其作為抗低氧損傷的藥物提供參考。
　　研究方法：
　　1.間歇低氧對(duì)大鼠氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響選取48只雄性Wistar大鼠，體重180~200g，隨機(jī)分為常氧組

4、和低氧組，每組各24只。常氧組在正常情況下飼養(yǎng)，低氧組大鼠于低壓氧艙中接受模擬6000米海拔高度、15℃的低壓低氧處理，每天8小時(shí)，其余時(shí)間在正常情況下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7d、14d、21d、28d后，常氧組和低氧組分別各取6只大鼠，取材后測(cè)定大鼠血清、心肌組織、腦組織、肝組織、腎組織中MDA含量、SOD和T-AOC水平研究其氧化應(yīng)激變化，以及檢測(cè)血清NO和ET含量、VEGF的表達(dá)觀察內(nèi)皮功能的變化。
　　2.間歇低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧

5、化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響采用主動(dòng)脈血管片貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)雄性 Wistar大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別設(shè)置對(duì)照組，間歇低氧組：對(duì)照組：21％O2，37℃，48h；間歇低氧27h組：低氧（1%O2，37℃）27h，再?gòu)?fù)氧（21%O2，37℃）21h；間歇低氧30h組：低氧（1%O2，37℃）30h，再?gòu)?fù)氧（21%O2，37℃）18h。分別在低氧和復(fù)氧結(jié)束后收集對(duì)照組和間歇低氧組細(xì)胞上清，檢測(cè)MDA、SOD、NO、ET水平變化。另設(shè)置正常

6、對(duì)照組、不同濃度H202組、低氧組及低氧復(fù)合H202組研究氧化應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。
　　3．膽堿抗低氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用體外培養(yǎng)雄性Wistar大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別設(shè)置對(duì)照組（21%O2，37℃）、低氧組（1%O2，37℃）、膽堿組、膽堿+拮抗劑組，檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放及VEGF的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.慢性間歇性低氧對(duì)大鼠氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響
　?。?）慢性

7、間歇性低氧對(duì)大鼠氧化應(yīng)激的影響血清：間歇低氧1、2、3周后，與對(duì)照組相比，低氧組大鼠血清MDA無(wú)顯著性變化；而間歇低氧4周后，與對(duì)照組相比，低氧組大鼠血清MDA水平顯著升高（P<0.05）；間歇低氧前3周，對(duì)照組與低氧組大鼠血清SOD水平無(wú)顯著性差異。間歇低氧4周后，與對(duì)照組相比，低氧組大鼠血清 SOD水平顯著降低；T-AOC水平在不同時(shí)間間歇低氧干預(yù)后均升高，并于第2、3、4周出現(xiàn)顯著性差異。心肌組織：與對(duì)照組相比，心肌組織MDA含量

8、在大鼠間歇低氧1、2、3、4周后均出現(xiàn)顯著性升高；SOD水平在不同低氧時(shí)間干預(yù)后均降低，且在第2、4周后出現(xiàn)顯著性降低；T-AOC水平也在各周后出現(xiàn)降低趨勢(shì)。腦組織：與對(duì)照組相比，腦組織MDA含量在大鼠間歇低氧1、2、3、4周后均有降低趨勢(shì)，且第4周后出現(xiàn)顯著性差異；SOD在不同低氧時(shí)間干預(yù)后均降低，且在第2周后出現(xiàn)顯著性降低；T-AOC在各周后出現(xiàn)不同程度的升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝組織：與對(duì)照組相比，肝組織MDA含量在大鼠間歇低氧1、

9、3、4周后均降低，且第4周后出現(xiàn)顯著性差異；SOD在不同低氧時(shí)間干預(yù)后均出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異；T-AOC在各周后出現(xiàn)不同程度的降低，且在第3、4周后出現(xiàn)極顯著性差異。腎組織：與對(duì)照組相比，肝組織MDA含量在大鼠間歇低氧各周后均有升高趨勢(shì)，且在第4周后出現(xiàn)顯著性差異；SOD在間歇低氧干預(yù)各周后出現(xiàn)降低趨勢(shì)；T-AOC在各周后出現(xiàn)升高趨勢(shì)，但各組間無(wú)顯著性差異。
　　（2）慢性間歇性低氧對(duì)大鼠內(nèi)皮功能的影響與對(duì)照組相比，大鼠血

10、清NO含量在第2周后開始降低，且第2周和第4周有顯著性差異；血清ET在不同時(shí)間間歇低氧干預(yù)后均有降低趨勢(shì)，且在第2周后出現(xiàn)顯著性差異；血清VEGF的表達(dá)在第1、2、4周后均有降低趨勢(shì)，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.間歇性低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能的影響
　　（1）間歇性低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響間歇低氧27h組，與對(duì)照組相比，低氧和復(fù)氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞MDA水平均無(wú)顯著性差異；間歇低氧30h組，與對(duì)照組相比，復(fù)氧

11、18h后間歇低氧組血管內(nèi)皮細(xì)胞 MDA水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，選擇低氧30h、復(fù)氧18h研究間歇低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。間歇低氧30h組細(xì)胞在復(fù)氧結(jié)束后SOD水平有降低趨勢(shì)，但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度 H2O2干預(yù)6h、12h、24h、27h后，各組細(xì)胞存活率并無(wú)顯著性差異。而干預(yù)30h后，與對(duì)照組相比，800μmol/L H2O2濃度組細(xì)胞存活率顯著下降，LDH的釋放顯著升高。與對(duì)照組相比，低氧組、H2O2組和低

12、氧復(fù)合 H2O2組細(xì)胞存活率顯著下降，H2O2組、復(fù)合組LDH的釋放顯著升高。
　　（2）間歇性低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮功能的影響與對(duì)照組相比，低氧結(jié)束后，間歇低氧組血管內(nèi)皮細(xì)胞NO水平顯著降低，ET水平顯著升高；而經(jīng)過(guò)18h的復(fù)氧，低氧組NO的釋放顯著升高，同時(shí)ET的釋放顯著降低。
　　3．膽堿抗低氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用：常氧條件下，膽堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24-48h，細(xì)胞存活率升高，而LDH沒有顯著差異；低氧條件下，

13、膽堿處理內(nèi)皮細(xì)胞24-48h，0.1-10μmol/L使大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活率升高，而降低LDH水平。低氧24h后內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF顯著升高，10μmol/L膽堿能夠進(jìn)一步增加內(nèi)皮細(xì)胞分泌 VEGF；低氧條件下，與膽堿孵育組相比，拮抗劑MLA組的細(xì)胞存活率顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1.慢性間歇性低氧暴露（模擬海拔6000m，8h/d）不同時(shí)間后可以使大鼠氧化應(yīng)激系統(tǒng)激活，血清、心肌組織、腦組織、肝組織、腎組織氧化

14、應(yīng)激程度不同，呈現(xiàn)各自特征性改變。慢性間歇性低氧可以使大鼠內(nèi)皮功能受到影響，其中一個(gè)顯著性變化就是NO生成減少。ET水平在間歇低氧的作用下也發(fā)生變化，VEGF水平?jīng)]有顯著性改變，提示慢性間歇性低氧對(duì)血管內(nèi)皮的通透性影響較小。
　　2.間歇低氧（1%O2，37℃，30h，再21%O2，37℃，18h）可以使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。不同程度的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷程度不同。本實(shí)驗(yàn)中，800μmol/LH2O2干預(yù)30h血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷