差速消化分離培養(yǎng)脂肪源性內(nèi)皮祖細胞(EPCs)及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、背景:內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是成熟內(nèi)皮細胞的前體細胞，可遷移到缺血組織，分化為成熟內(nèi)皮細胞(Enthothelial cells，ECs)，發(fā)揮血管新生作用。隨著EPCs研究的深入，其在臨床診斷、預(yù)后判斷和各種缺血性疾病的治療方面將會有廣闊的應(yīng)用前景。EPCs不僅存在于骨髓、外周血和臍血中，還存在于胚胎、心臟、骨骼肌和血管中。然而，這些來源的EPCs都存在一定的限制。因此，尋找合

2、適來源的EPCs就變得尤為重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中含有多種細胞，包括EPCs。脂肪組織不僅具有來源豐富，獲取容易且其對人體創(chuàng)傷較小的優(yōu)勢，而且其種子細胞豐富，適合細胞的自體移植，因此，脂肪組織是理想的EPCs種子細胞來源，但目前國內(nèi)外缺乏有效的分離培養(yǎng)脂肪源性EPCs的方法。
　　目的:探討一種有效、經(jīng)濟、可行的從人脂肪組織中分離培養(yǎng)EPCs的方法，并對其生物學(xué)特性展開研究。
　　方法:采用酶消化法從人脂肪組織中分

3、離培養(yǎng)出脂肪基質(zhì)血管細胞(Stromal vascular cells，SVF)，流式細胞術(shù)檢測SVF的免疫表型以分析其細胞成分。通過EPCs和脂肪干細胞(Adipose stem cells，ASCs)對胰蛋白酶的敏感性不同，差速消化分離EPCs和ASCs。觀察細胞的形態(tài)特征，繪制細胞的生長曲線、計算細胞的細胞倍增數(shù)(PD)和倍增時間(DT)評估細胞的生長增殖能力，流式細胞分析術(shù)檢測EPCs的表型特征，免疫熒光染色觀察細胞攝取FITC

4、-UEA-1和吞噬Dil-ac-LDL的能力。最后，通過體外成血管試驗分析EPCs的血管形成能力。
　　結(jié)果:通過差速消化分離法，成功從脂肪組織中分離出EPCs和ASCs。流式細胞術(shù)檢測分析顯示EPCs表達CD31、CD34和VEGFR2，而幾乎不表達造血干細胞表面標志CD45;體外擴增培養(yǎng)后呈典型的鋪路石樣形態(tài)，并可吞噬乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)和結(jié)合荊豆凝集素(FITC-UEA-1)，在熒光顯微鏡下觀察吞噬Di

5、l-ac-LDL的EPCs呈紅色熒光，而結(jié)合FITC-UEA-1呈綠色熒光。此外，將其接種于Matrigel人工基底膜，可形成血管腔樣的結(jié)構(gòu)。ASCs高度表達CD29、CD73、CD90、CD105等間充質(zhì)細胞表面標志，體外擴增培養(yǎng)呈長梭形纖維細胞樣生長。
　　結(jié)論:通過差速消化分離法成功從人脂肪組織中分離培養(yǎng)出EPCs，為脂肪源性EPCs的分離培養(yǎng)提供了一種有效、經(jīng)濟、可行的研究方法，為各種缺血性疾病提供了豐富的種子細胞來源，給