人表皮干細胞群體的分離方法及其生物學特性的研究.pdf

1、背景 皮膚是人體最大的器官。皮膚組織具有很強的再生能力，基底層中的表皮干細胞(keratinocytestemcells，KSC)在組織自我更新、損傷修復和腫瘤發(fā)生中起重要作用。隨著分子生物學、細胞生物學等學科的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)KSC的生物學特性主要有體內(nèi)慢周期性、能夠自我更新、具有高度增生的潛能。KSC已成為轉(zhuǎn)基因理想的靶細胞，可通過干細胞的基因轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)表皮異?；虮硇停辉谀[瘤的治療中，可以采用誘導干細胞分化或者干擾干細胞的方

2、法，消除腫瘤細胞；在銀屑病的治療學研究方面，有學者也開始了針對KSC的調(diào)控的研究，KSC的增生可能是銀屑病發(fā)病機理的關鍵環(huán)節(jié)，可能是今后治療銀屑病的一個方向。隨著KSC在基因治療、皮膚腫瘤、創(chuàng)傷修復等的研究中越來越受到重視，成功的分離和鑒定KSC就成為KSC研究中的一個熱門課題。目前文獻報道分離KSC的方法主要有Ⅳ型膠原快速黏附法、熒光激活細胞分選技術(shù)、低密度單克隆篩選法、磁性攪拌法等。鑒定KSC的方法是利用KSC細胞內(nèi)和細胞膜表面一些

3、特異性分子標志物。目前報道的KSC特異性分子標志物主要有β1整合素、P63、k19等。采用分離有增殖能力的裸表皮干細胞群體包括表皮干細胞和暫時增殖細胞(nakedstemcellpopulation，NSCP)的方法可能更適宜于對表皮細胞進行基因轉(zhuǎn)移等方面的研究。本研究是要探討一種或幾種既操作較簡單又能高效率的分離出KSC的方法。本實驗應用物理性的篩網(wǎng)過濾法和免疫學的基本原理的ELISA聚苯乙烯孔板包被法、Sepharose-4B柱層析

4、法濃集／分離正常人包皮內(nèi)具有增殖能力的NSCP，以探討三種方法的優(yōu)、缺點及NSCP生物學特性。這三種方法在有關干細胞研究的文獻中鮮有報道，它可應用于不同目的的實驗研究，為臨床上一些疾病的病因?qū)W和治療學的研究提供實驗基礎。 材料和方法 1.4例包皮標本均取自我院25～35歲行包皮環(huán)切術(shù)患者(患者均未檢出其它疾病)。應用熱溶素從皮膚分離出表皮，再使用胰蛋白酶和EDTA將表皮消化成表皮單細胞懸液。 2．對消化分離的人表

5、皮單細胞懸液進行不同目數(shù)篩網(wǎng)過濾，過濾后的細胞標本，進行Wright’s染色和P63單克隆抗體的免疫組化染色，觀察并計數(shù)表皮細胞形態(tài)學分類和免疫反應信號的定位。 3．將消化分離的人表皮單細胞懸液在P63抗體包被的ELISA聚苯乙烯孔板中進行濃集／分離NSCP，分離后的NSCP再進行P63／k19單克隆抗體的免疫組化染色，并計數(shù)濃集／分離NSCP前后的P63／k19免疫反應性(P63／k19immunoreactivity,P63

6、-IR／k19-IR)細胞百分率。 4．對消化分離的人表皮單細胞懸液通過P63抗體耦聯(lián)的Sepharose-4B層析柱(Sepharose-4B層析柱為自制的5mm×2．5cm的微柱)進行濃集／分離NSCP。將分離后的NSCP再進行P63／k19單克隆抗體的免疫組化染色。并計數(shù)濃集／分離NSCP前后的P63-IR／k19-IR細胞百分率。 5．將經(jīng)240目篩網(wǎng)過濾的單細胞懸液和經(jīng)k19抗體包被的ELISA聚苯乙烯孔板濃集

7、／分離的NSCP接種于6孔板中培養(yǎng)(培養(yǎng)基為DMEM+F12+10％FBS+多種細胞因子)，記錄其表皮細胞接種數(shù)、克隆形成率、融合出現(xiàn)天數(shù)并對融合后分化的表皮標本進行形態(tài)學觀察。 6．統(tǒng)計方法：采用SPSSl0．0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，以a=0．05為檢驗水準，以P

8、 1．篩網(wǎng)過濾后Wright’s染色的細胞標本中，表皮的基層細胞呈小圓形，直徑<11[tm，胞核染色呈深紫色，胞質(zhì)很少：無核的淺層表皮細胞呈大的多角形，直徑>20pm，胞質(zhì)染色呈淺紅色；中層細胞形態(tài)、大小居二者之間。經(jīng)240目篩網(wǎng)濾過的P63單克隆抗體免疫細胞化學標本中，P63．IR定位于直徑<11μm細胞(KSC)和直徑為11-20μm的細胞(暫時增殖細胞transient-ampliftingcells，TA)。240目、300

9、目和350目的Wright's染色的基層細胞百分率(％)分別為24．5±1．29、50．3±1．71和51．5±1．29；前者與后二者之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P.＜O．05)，后二者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>O．05)。240目、300目和350目的P63-IR陽性細胞％分別為40．3±1．71、52．3±0．96和53．0±1．41，前者與后二者之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，后二者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．0

10、5)。 2．分離的表皮單細胞懸液采用ELISA聚苯乙烯板P63抗體包被法分離后的表皮細胞涂片，進行P63／k19單克隆抗體的免疫組化染色。直徑<11μm的KSC細胞和直徑為11-20[tm的TA細胞呈P63．IR、k19-IR陽性；直徑>20pm的中層、淺層表皮細胞呈P63．IR、k19-IR陰性。P63抗體包被的ELISA法的洗脫前液、第一次洗脫液和第二次洗脫液P63．IR陽性細胞％分別為67．25±2．63、90±0．82和

11、91．25±2．5。k19抗體包被的ELISA法的洗脫前液、第一次洗脫液和第二次洗脫液k19-IR陽性細胞％分別為64．75±1．26、89．5±2．52和90．25±1．71。洗脫前液與第一次洗脫液和第二次洗脫液之間P63-IR／k19-IR陽性細胞％比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；而第一次洗脫液與第二次洗脫液細胞之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>O．05)。P63．IR組與k19-IR組的洗脫前液、第一次洗脫液和第二次洗脫液之間陽

12、性細胞％比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。而P63．IR組與k19-IR組之間陽性細胞％呈顯著正相關性(r=0．985，P<0．05)。 3．分離的表皮單細胞懸液采用Sepha/ose-4B的P63抗體包被柱層析法分離后的表皮細胞涂片，進行P63／k19單克隆抗體的免疫組化染色。洗脫前液、第一次洗脫液和第二次洗脫液的P63．IR陽性細胞％分別為74±1．63、90．25±2．22和92．25±1．26。洗脫前液、第一次洗脫液

13、和第二次洗脫液的k19-IR陽性細胞％分別為75．5±2．08、93．25±3．77和93．5±0．58。洗脫前液與第一次洗脫液和第二次洗脫液之間的P63．IR／k19-IR陽性細胞％比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；而第一次沈脫液和第二次洗脫液之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>O．05)。P63-IR組與k19-IR組的洗脫前液、第一次沈脫液以及第二次沈脫液之間陽性細胞％比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞O．05)。而P63-IR組與k19-

14、IR組之間陽性細胞％呈顯著正相關性(r=0．923，P<0．05)。 4．Sepharose-4B柱層析法與ELISA聚苯乙烯板包被法在P63-IR／kl9-IR陽性細胞％的分離效應方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，而呈顯著正相關性(r=0．963，r=0．959，P<0．05)。5．應用k19抗體包被的ELISA法濃集／分離的表皮細胞的接種數(shù)為207．5±9．57個／孔，低于經(jīng)240目篩網(wǎng)過濾的單細胞懸液組的10500

15、±577．35個／孔(P0．05)。經(jīng)240目篩網(wǎng)過濾單細胞懸液組接種細胞數(shù)與克隆形成率、克隆形成率與融合出現(xiàn)天數(shù)之間亦未呈現(xiàn)顯著相關性(r=0．455，r=O．174，P>0．05)。 6．融合后分化的表皮切片呈現(xiàn)復層、極化。

16、一些基層細胞呈現(xiàn)P63-IR陽性反應。 小結(jié) 1．篩網(wǎng)過濾法結(jié)果顯示300目和350目的篩網(wǎng)分離效率高于240目的篩網(wǎng)。該方法操作簡單但分離效率較低，能夠獲得不同數(shù)目的NSCP而用于不同的研究目的。 2．ELISA聚苯乙烯板包被法的結(jié)果顯示單克隆抗體P63與k19分離的陽性細胞百分率無顯著性差異。該方法分離效率較高，操作較簡單，而且分離的細胞經(jīng)接種后顯示良好的生長狀態(tài)并保持著細胞活力。 3．SeiShar