淋巴管內(nèi)皮祖細胞的分化及其生物學(xué)特征.pdf

1、目的:研究臍帶血中CD34+／CDl33+／VEGFR-3+淋巴管內(nèi)皮祖細胞經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)向淋巴管內(nèi)皮細胞分化過程中細胞表面形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和特征性抗原標志物等生物學(xué)特征的變化，探討淋巴管內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化的機制。方法:從臍靜脈中采取臍帶血，用Percoll密度梯度離心法分離單形核細胞，再用抗VEGFR-3抗體標記，然后用流式細胞儀分選VEGFR-3+內(nèi)皮祖細胞。用含有15％FBS、100IU／mL青霉素和100mg/L鏈霉素的

2、DMEM培養(yǎng)液對分選后的VEGFR-3+內(nèi)皮祖細胞進行培養(yǎng)。通過VEGF-C誘導(dǎo)，使VEGFR-3+內(nèi)皮祖細胞向內(nèi)皮細胞分化。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。在掃描電鏡和透射電鏡下觀察細胞表面和細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化。在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察特征性標志物的表達變化。結(jié)果:從臍帶血中分選出的VEGFR-3+內(nèi)皮祖細胞同時表達CD34和CDl33。剛分選出的CD34+／CDl33+／VEGFR-3+淋巴管內(nèi)皮祖細胞呈圓形或橢圓形，胞

3、質(zhì)中含有較多的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這兩種細胞器的斷面面積和與細胞質(zhì)的面積比約為3％。經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)后2d，細胞呈梭形，出現(xiàn)頭部和尾部。頭部較寬，從頭部伸出板狀偽足和數(shù)個絲狀偽足。絲狀偽足呈錐狀，長短不一。誘導(dǎo)后7d，多數(shù)細胞更加伸展。從細胞頭部伸出寬大、扁薄的板狀偽足，從板狀偽足伸出許多絲狀偽足。絲狀偽足長約為3～5gm，排列密集而規(guī)則。板狀偽足表面可觀察到散在的微絨毛，長約1．5～2gm。與剛分選出的淋巴管內(nèi)皮祖細胞比較，誘導(dǎo)后7

4、d的細胞細胞質(zhì)中含有更豐富的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這兩種細胞器的斷面面積和與細胞質(zhì)的面積比約為9％。胞質(zhì)中出現(xiàn)許多吞飲小泡。祖細胞標志物CDl33表達減弱。經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)后14d，細胞體積變大，呈梭形或多邊形，呈現(xiàn)內(nèi)皮細胞的形態(tài)特征，細胞和細胞之間相互連接，呈單層排列。細胞偽足減少，表面可見許多散在分布的細胞小凹和微絨毛。胞質(zhì)中可觀察到有膜包被的Weibel-Palade小體。細胞表達淋巴管內(nèi)皮細胞特異性標志物L(fēng)YVE．1和5．核苷酸