單核細(xì)胞來(lái)源的多潛能細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的可行性.pdf

1、研究背景：迄今為止，淋巴水腫尚無(wú)理想的治療措施。特別是近些年來(lái)乳腺癌發(fā)病率逐年上升，乳腺癌根治術(shù)引起的患側(cè)上肢繼發(fā)性淋巴水腫病例隨之增多。該并發(fā)癥一旦發(fā)生，常逐漸發(fā)展成整個(gè)上肢水腫甚至硬化。促進(jìn)淋巴管新生無(wú)疑是治愈淋巴水腫的關(guān)鍵措施，其中，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生是重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，單核巨噬細(xì)胞在組織修復(fù)、免疫排斥反應(yīng)、惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移等許多病理生理過(guò)程中，通過(guò)分泌VEGF-C/D等細(xì)胞因子促進(jìn)淋巴管增生，或直接整合到淋巴管壁上，參與淋

2、巴管新生。另外，研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞不僅是巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)能分化成多潛能細(xì)胞(MOMCs)或內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，后者在VEGF等作用下能分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞。因此，近些年來(lái)，將EPCs用于血管再生、治療缺血性疾病的研究一直是近些年來(lái)非?；钴S的課題。然而，單核細(xì)胞來(lái)源的MOMCs或EPCs能否轉(zhuǎn)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本文從CD14+單核細(xì)胞獲得MOMCs之后，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)RT-PCR和熒光免疫細(xì)胞化

3、學(xué)技術(shù)，檢測(cè)不同階段細(xì)胞的淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-1、Podoplanin、Prox-1、VEGFR-3及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-2、CD144、vWF、CD34的基因和蛋白表達(dá)，觀察其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性。
　　 目的：本研究旨在探討在體外單核細(xì)胞分化成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的可能性，為進(jìn)一步研究淋巴管新生提供理論依據(jù)。
　　 方法：取健康成人新鮮外周血，提取單個(gè)核細(xì)胞：①未用FN鋪板，用L-DMEM加10％

4、FBS培養(yǎng)8-12h后，收集貼壁細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)；②將單個(gè)核細(xì)胞接種到鋪有FN的培養(yǎng)板，用L-DMEM加10％FBS培養(yǎng)7-10d后，獲得MOMCs;另外一組細(xì)胞，在同時(shí)收細(xì)胞前24h，添加10ng/ml的腫瘤壞死因子a(TNF-a)刺激；用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-I、Podoplanin、Proxl、VEGFR-3以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF、CD144、VEGF

5、R-2、CD34的基因和蛋白表達(dá)；③將MOMCs換用EGM-2繼續(xù)培養(yǎng)3-7d，用RT-PCR和熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法，分別檢測(cè)細(xì)胞對(duì)淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的基因和蛋白表達(dá)；對(duì)用TNF-a刺激24h的MOMCs，采用同樣方法繼續(xù)培養(yǎng)3d，用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)上述標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①未用FN鋪板，8-12h短期培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞約有96％為CD14+單核細(xì)胞；RT-PCR結(jié)果顯示，細(xì)胞對(duì)于VEGFR-

6、3表達(dá)呈弱陽(yáng)性，LYVE-I、Podoplanin、Proxl、vWF、CD144、VEGFR-2、CD34的表達(dá)均呈陰性；②MOMCs.RT-PCR結(jié)果顯示對(duì)于VEGFR-3、Podoplanin、Prox-1、CD34、vWF的表達(dá)均呈陽(yáng)性，而LYVE-1、CD144、VEGFR-2表達(dá)呈陰性；熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)VEGFR-3、VEGFR-2的蛋白表達(dá)，結(jié)果均呈陽(yáng)性；TNF-a刺激24h的MOMCs，其RT-PCR結(jié)果顯示，V

7、EGFR-3、Podoplanin、Prox-1、CD34、vWF的表達(dá)亦均呈陽(yáng)性，而LYVE-1、CD144、VEGFR-2表達(dá)呈陰性；③EGM-2誘導(dǎo)MOMCs3d后，RT-PCR結(jié)果顯示，除了VEGFR-3表達(dá)呈陰性，LYVE-I、Podoplanin、Prox-1、CD34、CD144、VEGFR-2及vWF均呈陽(yáng)性；采用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示對(duì)于VEGFR-3、LYVE-I、Podoplanin、VEGFR-2及vWF

8、均不同程度的呈陽(yáng)性；繼續(xù)培養(yǎng)7d后，RT-PCR結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)于LYVE-1、Podoplanin、Prox-1、CD34、vWF的表達(dá)呈陽(yáng)性，但與前者相比，相應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)強(qiáng)度均減弱，而VEGFR-3、CD144、VEGFR-2呈陰性；對(duì)用TNF-a刺激24h的MOMCs，繼續(xù)培養(yǎng)3d后，RT-PCR結(jié)果顯示，Podoplanin、Prox-1、CD34、vWF呈陽(yáng)性，但與由MOMCs誘導(dǎo)3d的細(xì)胞相比，相應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)強(qiáng)度均明顯減