天然產(chǎn)物與OATP1B1相互作用的研究和OATP2B1N-糖基化對(duì)功能和表達(dá)的影響.pdf

1、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP）1B1是重要的肝攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)很多內(nèi)源性物質(zhì)和外源性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞。為了鑒別和研究天然產(chǎn)物中潛在的OATP1B1的調(diào)節(jié)劑，本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定表達(dá)OATP1B1的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO），在96孔板中測(cè)定了21種常見(jiàn)天然化合物和提取物對(duì)OATP1B1介導(dǎo)熒光素甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。該方法可進(jìn)一步應(yīng)用于高通量篩選大化合物庫(kù)。
　　結(jié)果表明：若干黃酮類化合物（如槲皮素、槲皮苷、蘆丁、菊花梗葉總黃酮和桑皮黃

2、素等）和三萜類化合物（如甘草次酸和甘草酸等）在體外實(shí)驗(yàn)中顯著抑制了OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其IC50值均小于16μM；黃酮類化合物比其對(duì)應(yīng)的糖苷類化合物的抑制作用更強(qiáng)，而且糖的類型和糖鏈長(zhǎng)度對(duì)其抑制作用均有影響。為了考察這些化合物對(duì)OATP1B1介導(dǎo)其他底物攝取的影響，我們建立了檢測(cè)OATP1B1藥物底物氟伐他汀和羅伐他汀的LC-MS/MS方法。研究結(jié)果表明，天然產(chǎn)物對(duì)OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響具有底物依賴性。本論文的研究結(jié)果將有助

3、于預(yù)測(cè)和避免潛在的OATP1B1介導(dǎo)的不良藥物-藥物和藥物-食物相互作用，為臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。
　　有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2B1（OATP2B1）表達(dá)在胎盤(pán)、肝臟、乳腺、腦和腸等組織中，介導(dǎo)四溴酚酞磺酸鈉、3-硫酸雌酮和3-硫酸脫氫表雄酮等的轉(zhuǎn)運(yùn)。糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，OATPs的共有結(jié)構(gòu)特征—潛在的N-糖基化位點(diǎn)位于胞外環(huán)2和5上。為探究OATP2B1上N-糖基化對(duì)其表達(dá)及功能的影響，我們首先使用生物信息學(xué)

4、軟件預(yù)測(cè)4個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，并該對(duì)應(yīng)位點(diǎn)處的將天冬酰胺突變成谷氨酰胺，得到四個(gè)單突變（N146Q、N176Q、N350Q和N538Q）和一個(gè)雙突變（N176/538Q）。然后對(duì)于這些OATP2B1突變體的功能和表達(dá)的評(píng)估實(shí)驗(yàn)在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行。
　　結(jié)果表明：OATP2B1上的天冬酰胺176和538是糖基化位點(diǎn)。當(dāng)這兩個(gè)位點(diǎn)被分別突變時(shí)，均使得蛋白水平降低以及轉(zhuǎn)運(yùn)活性顯著降低；當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)被同時(shí)突變時(shí)，蛋白水平顯著下調(diào)，同