沙門菌毒力基因spvB抑制細胞自噬的分子機制及對斑馬魚感染模型的影響.pdf

1、目的：
　　沙門菌（Salmonella）是寄生在人和動物腸道內(nèi)可引起多種疾病的腸道致病菌，主要經(jīng)水和食物傳播。沙門菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence gene, spv）與細菌毒力密切相關(guān)，其毒力表型主要由三個區(qū)域介導(dǎo)，包括調(diào)節(jié)基因 spvR、效應(yīng)基因spvB和spvC。文獻報道spvB的編碼產(chǎn)物具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可誘導(dǎo)細胞骨架解聚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)spvB可抑制宿主細胞自噬體

2、的形成，但相關(guān)的分子機制尚不清楚。
　　本研究第一部分以人宮頸癌上皮細胞HeLa（human epithelial cell line）為感染模型，通過自噬通量和自噬體形成過程與細胞骨架的相互作用為研究點，探究spvB影響自噬體形成的分子機制。第二部分建立斑馬魚感染模型，深入研究在動物體內(nèi)spvB基因?qū)ι抽T菌感染后腸道上皮細胞自噬及感染結(jié)局的影響，揭示沙門菌毒力基因的致病機制，為治療和控制腸道感染性疾病提供新思路。
　　方法

3、：
　　一.沙門菌毒力基因spvB抑制細胞自噬的分子機制
　　本課題第一部分選用鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. typhimurium，STM）野生株 STM-WT（攜帶沙門菌毒力基因 spvB）、突變株STM-ΔspvB（消除 spvB基因）和回補株 STM-c-ΔspvB（利用重組載體將 spvB導(dǎo)入ΔspvB）分別感染HeLa細胞，建立體外細胞感染模型

4、，進行下面實驗：
　　1.透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)
　　收集感染后1 h和2 h的細胞，制作超薄切片，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察三株菌感染HeLa后細胞的超微結(jié)構(gòu)，比較感染不同時間點細胞內(nèi)自噬體的形成及細菌的侵襲情況。
　　2.共聚焦激光顯微鏡觀察LC3點狀聚集
　　用mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，細菌與細胞共作用1 h

5、后，在共聚焦激光顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）下觀察細菌感染后細胞內(nèi) LC3的點狀聚集；利用自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）和自噬抑制劑巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1，Baf）預(yù)處理，比較不同感染組之間黃色LC3的點狀凝集顆粒的數(shù)目，以及藥物干預(yù)前后LC3點狀凝集顆粒的變化。
　　3.共聚焦激光顯微鏡觀察細胞骨架、蛋白與細菌的共定位
　

6、　將細胞鋪入含小圓玻片的24孔板中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別轉(zhuǎn)染EGFP-Beclin-1、EGFP-Atg14和pGFP-ZFYVE1質(zhì)粒，與細菌共作用1 h后，用鬼筆環(huán)肽（phalloidin）染色細胞骨架，呈現(xiàn)紅色，利用沙門菌特異性抗體與熒光二抗結(jié)合后對細菌進行著色，將細菌標(biāo)記為藍色，借助共聚焦激光顯微鏡觀察細胞骨架、蛋白與細菌三者的共定位。
　　4.熒光顯微鏡下觀察p62與感染細菌共定位
　　收集感染后1

7、h的細胞，抗體孵育后，熒光顯微鏡下觀察各感染組中細菌與p62蛋白共定位情況，計算共定位的細菌占侵入細胞內(nèi)細菌總數(shù)的百分比。
　　5. Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白和p70S6K磷酸化的水平
　　收集感染后1 h和2 h的細胞，采用蛋白免疫印跡（Western blot，WB）法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3，p62和Beclin-1的表達水平；在RAPA和Baf藥物干預(yù)后，觀察不同感染組之間自噬相關(guān)蛋白表達水平的變化。

8、
　　收集感染后1 h和3 h的細胞，Western blot法檢測mTOR信號通路下游p70S6K蛋白表達水平，分析各不同感染組之間磷酸化表達水平的變化。
　　6.平板計數(shù)法計算胞內(nèi)活菌數(shù)
　　收集感染感染后30 min、1 h、3 h和5 h的HeLa細胞，計算細胞胞內(nèi)菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）。平板菌落計數(shù)法分別記錄不同感染組中胞內(nèi)菌的個數(shù)。
　　二.沙門菌毒力基因spv

9、B對斑馬魚感染模型自噬和腸道病變的影響
　　由于回補株STM-c-ΔspvB需用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)才能表達，不適合用于體內(nèi)實驗，所以本課題第二部分只選用鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-ΔspvB作為體內(nèi)實驗菌株。
　　1.構(gòu)建斑馬魚腸道感染模型
　　選取受精后5 dpf（days post-fertilization，dpf）的斑馬魚幼魚，用Holtfreter buffer將菌液稀釋至1×109 cfu/ml、1×1

10、08 cfu/ml、1×107 cfu/ml、1×106 cfu/ml、1×105 cfu/ml、1×104 cfu/ml，采用浸染法感染6 hpi（hours post infection，hpi）后，將斑馬魚放入Holtfreter buffer中，統(tǒng)計感染后7 d斑馬魚的死亡數(shù)目，繪制存活率曲線，計算半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）以確定感染最適濃度及不同菌株對斑馬魚生存的影響。
　　2.平板菌落

11、計數(shù)法分析細菌在斑馬魚體內(nèi)的侵襲及播散能力
　　收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi幼年斑馬魚，利用平板菌落計數(shù)法計算斑馬魚全魚體內(nèi)細菌量，同時進行阿米卡星（Amikacin，AMK）殺菌實驗，計數(shù)殺死胞外菌后，入侵到斑馬魚胞內(nèi)的活菌數(shù)，檢測細菌的播散能力及體內(nèi)繁殖情況。
　　3.檢測斑馬魚體內(nèi)自噬水平
　　收集感染不同時間點的斑馬魚，檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達，比較鼠

12、傷寒沙門菌STM-WT和STM-ΔspvB隨感染時間的延長，斑馬魚體內(nèi)自噬水平的變化；用透射電子顯微鏡觀察兩株菌在72 hpi斑馬魚腸道超微結(jié)構(gòu)的變化及體內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)的形成。
　　4.斑馬魚感染后腸道的病理學(xué)改變及凋亡水平測定
　　用鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-ΔspvB分別感染5 dpf斑馬魚，比較兩株菌感染不同時間點對斑馬魚腸道的影響，普通光學(xué)顯微鏡觀察斑馬魚腸腔的變化；病理切片HE染色觀察腸道粘膜的病理學(xué)改變；用

13、Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達，同時采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測斑馬魚體內(nèi)凋亡調(diào)控基因bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　5.檢測沙門菌感染斑馬魚后體內(nèi)炎癥反應(yīng)及巨噬細胞的吞噬功能
　　分別取6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑馬魚觀察細菌感染對斑馬魚炎癥反應(yīng)的影響。qRT-PCR檢測TNFα，IL-1β，IL-22和IL-10的mRNA水平。中性紅染色法檢測

14、斑馬魚體內(nèi)在不同感染組中隨感染時間的延長巨噬細胞吞噬功能的變化。
　　結(jié)果：
　　一.沙門菌毒力基因spvB抑制細胞自噬的分子機制
　　1. spvB抑制自噬體形成：用TEM觀察STM感染后HeLa細胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示突變株STM-ΔspvB感染后1 h出現(xiàn)典型雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)，隨著感染時間的延長，在感染后2h出現(xiàn)單層膜的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包裹著細胞器和一些待降解的物質(zhì)成分，而在野生株STM-WT和回補株STM-

15、c-ΔspvB感染組中未見到自噬體形成，但可觀察到含沙門菌囊泡（Salmonella-containing vacuoles，SCV）和胞內(nèi)菌明顯增多，且隨感染時間的延長，細菌數(shù)量顯著增加。
　　2. spvB抑制自噬體形成的早期階段：用mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過CLSM觀察LC3點狀凝集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株STM-ΔspvB感染組中黃色LC3點狀聚集明顯多于攜帶 spvB基因的STM感染組，且突變株感染組中藍色細

16、菌周圍存在黃色LC3點狀聚集。經(jīng)RAPA和Baf藥物干預(yù)后，結(jié)果顯示，突變株STM-ΔspvB感染組中黃色LC3點狀聚集仍然多于其他兩組攜帶spvB基因的感染組，且藍色細菌周圍存在黃色LC3的聚集。
　　3. spvB影響自噬相關(guān)蛋白表達：Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3，p62及Beclin-1的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株STM-ΔspvB感染組中胞漿型LC3（即LC3-I）向膜型（即LC3-II）的轉(zhuǎn)化量顯著高于野

17、生株STM-WT和回補株STM-c-ΔspvB感染組，Beclin-1的表達水平明顯高于其他感染組，而自噬底物蛋白p62表達水平顯著低于其他感染組。RAPA處理后，STM-ΔspvB感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量和Beclin-1均有所增加，p62則較其他各組有明顯下降。Baf干預(yù)后，各感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量顯著增加，p62表達量也較其他各干預(yù)組有顯著增加，STM-ΔspvB感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量、Beclin-1和p62表達水平均高于STM-

18、WT和STM-c-ΔspvB。
　　4. spvB抑制p62與胞內(nèi)菌的共定位：利用免疫熒光法檢測p62與感染細菌共定位，在熒光顯微鏡下觀察，突變株STM-ΔspvB感染組中p62點狀聚集較其他感染組顯著增多，且 p62與細胞內(nèi)感染細菌的共定位明顯增加，而在STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組中僅發(fā)現(xiàn)有少量的p62與細胞內(nèi)感染細菌共定位。
　　5.通過 CLSM觀察細菌與細胞骨架及蛋白的共定位：結(jié)果顯示 STM-WT和S

19、TM-c-ΔspvB感染后1 h可誘導(dǎo) HeLa細胞中 F-Actin肌動蛋白絲解聚，同時Beclin-1、Atg14和ZFYVE1蛋白表達量顯著降低，在突變株STM-ΔspvB感染組中，細胞肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)明顯，且細菌分別與Beclin-1、Atg14和ZFYVE1蛋白發(fā)生共定位。
　　6. spvB通過 mTOR信號通路抑制宿主細胞自噬：Western blot檢測磷酸化p70S6K蛋白，結(jié)果顯示突變株STM-ΔspvB感染后1

20、 h，p70S6K磷酸化水平較其他感染組明顯降低，這種現(xiàn)象在感染后3h仍然存在。
　　7. spvB可促進細菌在胞內(nèi)的繁殖：胞內(nèi)CFU計數(shù)，結(jié)果顯示在感染后1 h胞內(nèi) CFU即出現(xiàn)差異，感染后3 h出現(xiàn) STM-ΔspvB感染組胞內(nèi) CFU顯著低于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組，這種差異在感染后5 h更加顯著。
　　二.沙門菌毒力基因spvB對斑馬魚感染模型自噬和腸道病變的影響
　　1.建立斑馬魚腸道感染模

21、型：STM感染5 dpf的斑馬魚建立體內(nèi)感染模型，通過記錄7 d內(nèi)感染不同劑量間斑馬魚的死亡和存活率，確定1×108 cfu/ml為感染最適菌量，并繪制生存曲線及計算半數(shù)致死量 LD50，結(jié)果顯示斑馬魚死亡數(shù)量隨感染濃度的遞減而減少，隨感染時間的延長而增加。用 Reed-Muench法計算STM-WT和 STM-ΔspvB對斑馬魚的致病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) STM-WT的LD50為1.33×106cfu/ml，STM-ΔspvB的LD50為2.

22、22×106cfu/ml，說明spvB可顯著降低沙門菌對斑馬魚的LD50。
　　2.觀察STM在斑馬魚體內(nèi)的播散及繁殖情況：采用平板菌落計數(shù)法記錄STM感染后斑馬魚體內(nèi)細菌的侵襲、播散及繁殖能力，結(jié)果顯示斑馬魚體內(nèi)感染細菌菌量隨感染時間的延長而成指數(shù)增加；加入阿米卡星（Amikacin，AMK）作用后，發(fā)現(xiàn)各組細菌菌量均有所減少，在72 hpi斑馬魚體內(nèi)感染鼠傷寒沙門菌STM-WT的菌量顯著高于感染STM-ΔspvB，這種差異在1

23、20 hpi更加明顯，說明spvB具有促進細菌入侵，增強細菌繁殖的能力。
　　3.檢測沙門菌感染對斑馬魚體內(nèi)自噬的影響：收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑馬魚，檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達，結(jié)果顯示突變株STM-ΔspvB在72 hpi LC3的轉(zhuǎn)化量顯著高于攜帶spvB的STM感染組，Beclin-1的表達水平明顯高于其他感染組，而自噬底物蛋白 p62表達水平顯著低于其他感染

24、組。用 TEM觀察沙門菌感染72 hpi斑馬魚腸道超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示突變株STM-ΔspvB感染組中斑馬魚腸道組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)。野生株STM-WT感染組中可看到大量的沙門菌入侵斑馬魚腸道上皮粘膜層，且腸道微絨毛排列紊亂，甚至出現(xiàn)脫落現(xiàn)象且腸道柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)不清晰。
　　4.觀察沙門菌感染后斑馬魚腸道的形態(tài)學(xué)改變及凋亡水平測定：通過普通光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野生株STM-WT感染組中，斑馬魚腸道隨感染時間的延長腸腔變

25、窄，腸道內(nèi)容物模糊不清，腸腔內(nèi)面積減少，而突變株STM-ΔspvB感染組中，斑馬魚腸道病變明顯較野生株輕。病理切片后HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，隨感染時間的延長斑馬魚腸道上皮微絨毛排列紊亂，在120 hpi腸腔內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，突變株STM-ΔspvB感染組中斑馬魚腸道病變較野生株輕，但也觀察到不同程度的腸腔狹窄和炎性細胞浸潤。Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)120 hpi STM-WT感染組中Bcl-2

26、表達顯著低于STM-ΔspvB感染組，同時采用qRT-PCR檢測bcl-2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)在120 hpi野生株STM-WT感染組中bcl2表達顯著低于突變株STM-ΔspvB感染組。
　　5.沙門菌感染后斑馬魚體內(nèi)炎癥反應(yīng)及吞噬細胞的吞噬功能：利用實時熒光定量PCR分析TNFα，IL-1β，IL-22和IL-10在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示STM-WT感染組中以上基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間的延長而逐漸升高，在感染后

27、6 h STM-WT和STM-ΔspvB感染組中斑馬魚體內(nèi)炎癥的標(biāo)志性基因表達水平并無顯著性差異，感染后120 h STM-ΔspvB感染組中炎癥的標(biāo)志性基因的表達顯著低于STM-WT感染組。沙門菌感染誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)固有免疫應(yīng)答，中性紅染色法檢測斑馬魚感染后巨噬細胞吞噬能力，分別收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi四個時間點感染鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-ΔspvB的斑馬魚，采用中性紅染色液對斑馬魚體內(nèi)巨噬細

28、胞進行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長，各感染組中斑馬魚體內(nèi)巨噬細胞吞噬功能均不斷升高，兩組細菌感染后巨噬細胞吞噬功能未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. spvB基因通過解聚細胞骨架從而抑制細胞自噬體形成。
　　2. spvB基因產(chǎn)物通過激活mTOR信號通路從而抑制宿主細胞自噬體形成。
　　3. spvB基因可增強細菌毒力，加強對斑馬魚腸道的致病性，影響斑馬魚體內(nèi)自噬水平，誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)炎癥反應(yīng)，對巨噬細胞吞噬