干酪乳桿菌對(duì)斑馬魚抵御氣單胞菌感染的分子機(jī)制研究.pdf

1、疾病暴發(fā)，如氣單胞菌引起的魚類出血病，已經(jīng)成為目前限制魚類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要問題。益生菌在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、維持機(jī)體腸道健康、增強(qiáng)免疫防御功能及保護(hù)宿主免受病原菌感染等方面起重要作用。本文通過轉(zhuǎn)座子基因突變文庫(kù)的構(gòu)建、目的基因篩選、基因敲除、轉(zhuǎn)錄組、無菌斑馬魚模型以及菌群轉(zhuǎn)接模型等方法分別對(duì)氣單胞菌的感染機(jī)制、益生菌促生長(zhǎng)及其抗氣單胞菌感染機(jī)制進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　一、氣單胞菌感染機(jī)制的研究
　　2009-

2、2014期間從中國(guó)華南地區(qū)出血病爆發(fā)塘口的病魚中分離得到的病原菌一共有五種:維氏氣單胞菌(A.veronii)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、簡(jiǎn)氏氣單胞菌(A.jandaei)、舒氏氣單胞菌(A.schubertii)及水生氣單胞菌（A.aquariorum），其中維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌是二種最重要的病原菌。另外，維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的混合感染是引起華南地區(qū)魚類敗血癥爆發(fā)的主要原因，維氏氣單胞菌是造成感染的前提條件

3、。采用浸浴模型和腹腔注射模型對(duì)氣單胞菌毒力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在浸浴模型中維氏氣單胞菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的毒力，而嗜水氣單胞菌的毒力相對(duì)較弱;而在腹腔注射模型中，嗜水氣單胞菌的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維氏氣單胞菌，注射嗜水氣單胞菌后10-18h內(nèi)斑馬魚死亡率為100％，而注射維氏氣單胞菌96h后死亡率僅為10-40％;在混合感染過程中，由維氏氣單胞菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌的氣溶素(aerolysin)可以對(duì)斑馬魚頭部口腔周圍以及腸道部位造成嚴(yán)重的損傷，使嗜水氣單

4、胞菌等其他細(xì)菌通過損傷部位進(jìn)入到斑馬魚體內(nèi)，產(chǎn)生敗血癥。用氣溶素基因敲除的維氏氣單胞菌斑馬魚感染，不會(huì)產(chǎn)生腸道損傷及死亡;RtxA基因的ACD結(jié)構(gòu)域敲除后，嗜水氣單胞菌毒力明顯降低（P＜0.01），證明了Aer和RtxA分別在維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的致病性上起著關(guān)鍵作用。
　　二、益生菌促進(jìn)斑馬魚生長(zhǎng)作用的機(jī)制研究
　　益生菌的促生長(zhǎng)效果:評(píng)價(jià)了五種乳桿菌，包括鼠李糖乳桿菌LGG(L.rhamnosus LGG)、鼠李糖

5、乳桿菌20300(L.rhamnosus20300)、干酪乳桿菌BL23(L.casei BL23)、植物乳桿菌1149(L.plantarum JCM1149)及嗜酸乳桿菌1132（L.acidophilus JCM1132）對(duì)斑馬魚的促生長(zhǎng)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌BL23和鼠李糖乳桿菌20300以106CFU/mL連續(xù)浸浴21d或35d后可以顯著提高斑馬魚的體重(P＜0.05);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BL23活菌（106CFU/mL）連續(xù)

6、浸浴處理斑馬魚幼魚14d或28d后，可顯著提高其體重(P＜0.05)，而熱滅活BL23不能提高斑馬魚的體重;數(shù)字基因表達(dá)譜分析（DGE）發(fā)現(xiàn)BL23活菌可以參與調(diào)節(jié)斑馬魚PPAR信號(hào)通路、氨基酸代謝、脂肪酸代謝以及固醇類激素的合成等，從而促進(jìn)斑馬魚生長(zhǎng)發(fā)育。
　　三、益生菌促進(jìn)斑馬魚抵御氣單胞菌感染的機(jī)制研究
　　干酪乳桿菌BL23浸浴處理剛孵化的斑馬魚3d后，再用維氏氣單胞菌攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL23可以顯著提高斑馬魚的存活率

7、(P＜0.01)，結(jié)合無菌斑馬魚模型和菌群轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)表明，BL23抗氣單胞菌感染的機(jī)制與改變腸道菌群無關(guān)，而與其菌體本身相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BL23細(xì)胞提取物胞外多糖-蛋白復(fù)合物(EPSP)由40-45KD大小蛋白和α-由鼠李糖(α-Rha)，α-葡萄糖(α-Glc)，β-N乙酰葡萄糖（β-GlcNAc）和β-N乙酰半乳糖(β-GalNAc)組成的胞外多糖所組成。用10-20μg/ml EPSP處理無菌斑馬魚，3d后用維氏氣單胞菌攻毒，