大腸桿菌嚴(yán)重感染引起斑馬魚幼魚髓系應(yīng)急造血機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥是十分常見而又重要的基本病理過程，當(dāng)在感染等應(yīng)急條件下，機(jī)體需要快速生成大量免疫細(xì)胞來應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，而生成大量免疫細(xì)胞的過程則被稱為應(yīng)急性造血。但是免疫細(xì)胞的應(yīng)急性產(chǎn)生以及與病原體相互作用的動(dòng)態(tài)過程仍不被人們熟知。而且，作為所有血液細(xì)胞來源的造血干祖細(xì)胞（HSPC）是否在免疫過程發(fā)揮作用，這仍沒有非常明確的答案。
　　脊椎動(dòng)物系統(tǒng)性感染病原體（例如細(xì)菌）時(shí)會(huì)出現(xiàn)一種類似菌血癥的癥狀。此時(shí)，血液細(xì)胞特別是白細(xì)胞會(huì)立即做出反應(yīng)，大

2、量增生以消滅病原體。在此過程中大量細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，例如Irf8、Pu.1。髓系白細(xì)胞包括單核細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）和多形核吞噬細(xì)胞（粒細(xì)胞），基于這兩種細(xì)胞非特異性的吞噬能力，他們往往作為抵御外界病原體入侵機(jī)體的第一道防線。粒細(xì)胞是外周血的重要組成部分，它們?cè)诘钟鈦砑?xì)菌時(shí)發(fā)揮重要作用，基于此，粒細(xì)胞會(huì)大量消耗，但隨后會(huì)大量擴(kuò)增，而這就是應(yīng)急性粒細(xì)胞生成，是清除病原體過程中不可或缺的免疫反應(yīng)部分。巨噬細(xì)胞因其強(qiáng)大的吞噬消化能力而成為清除

3、病原體以及死細(xì)胞的重要成員，特別是在緩解感染引起的炎癥方便起重要作用。
　　近年來，斑馬魚（Danio rerio），這種原產(chǎn)于喜馬拉雅山脈東南區(qū)域的觀賞用熱帶淡水魚，在過去的幾十年中，因其繁殖快、易于飼養(yǎng)、身體透明、體積小的巨大優(yōu)勢(shì)，正作為一種脊椎模式動(dòng)物漸漸被應(yīng)用于科學(xué)研究。本研究中，通過靜脈顯微注射，使受精后2天的斑馬魚系統(tǒng)性感染大腸桿菌（E.coli）以引起應(yīng)急性造血。感染條件下，巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞會(huì)迅速反應(yīng)吞噬消滅微生物。

4、巨噬細(xì)胞基本執(zhí)行吞噬行為，但粒細(xì)胞會(huì)依據(jù)不同的感染方式以及不同的微生物而產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。
　　眾所周知,血液細(xì)胞是一個(gè)大家族,主要有3大系,即紅系（由紅細(xì)胞、血小板組成），髓系（由巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞構(gòu)成）以及淋系（由T、B淋巴細(xì)胞組成）,整個(gè)血液細(xì)胞家族最初來源于一個(gè)共同的祖細(xì)胞即源于中胚層的造血干細(xì)胞(HSC)。造血干細(xì)胞（HSC）是一類特殊的靜止期細(xì)胞，它能夠自我更新以維持體內(nèi)平衡，也能夠在機(jī)體需要時(shí)分化成各種細(xì)胞類型。我們

5、知道，髓系細(xì)胞的大量擴(kuò)增會(huì)引起其前體細(xì)胞的活化，但是否HSC也會(huì)被活化參與免疫反應(yīng)呢，我們不得而知。因?yàn)槲覀兪峭ㄟ^不同的細(xì)胞表面的血系標(biāo)記物來區(qū)分不同的細(xì)胞，但是HSC的標(biāo)記物尚未確定，所以很難得到真正的HSC，但是我們可以通過標(biāo)記物得到造血干/祖細(xì)胞（HSPC）。許多研究已經(jīng)證明HSPC在病原體或相關(guān)物質(zhì)引起的感染情況下會(huì)擴(kuò)增，例如脂多糖（LPS）。但是也有研究證明感染條件下HSPC并不會(huì)發(fā)生反應(yīng)甚至在有些情況下會(huì)數(shù)目降低。所以，不同

6、病原體感染不同宿主引起HSPC不同的反應(yīng)，HSPC的變化應(yīng)視具體情況而定。
　　高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)，它的出現(xiàn)使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序。為了更進(jìn)一步探索感染后幼魚機(jī)體RNA水平的變化情況，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果顯示感染后大量的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化，而這種變化表明感染后機(jī)體的免疫應(yīng)答先是受到抑制隨后啟動(dòng)，直至完成對(duì)細(xì)菌的清理。該結(jié)果與細(xì)胞水平髓系細(xì)胞先被消耗

7、隨后大量擴(kuò)增的結(jié)果相符合。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)我們選取了改變較明顯且是血液發(fā)育至關(guān)重要的調(diào)控因子的Pu.1作為重點(diǎn)研究對(duì)象。
　　在髓系前體細(xì)胞向巨噬細(xì)胞或是粒細(xì)胞的分化過程中。Pu.1表達(dá)水平的高低是細(xì)胞命運(yùn)的決定因素。進(jìn)一步的研究表明，Pu.1在調(diào)控淋系及髓系細(xì)胞的分化過程有一個(gè)劑量依賴的關(guān)系，Pu.1高表達(dá)會(huì)促進(jìn)髓系，尤其是巨噬細(xì)胞的生成，而低表達(dá)則促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pu.1突變體感染E.coli后，髓系吞噬細(xì)

8、胞及其前體細(xì)胞依然會(huì)大量擴(kuò)增，但跟野生型相比，除巨噬細(xì)胞增加水平高于野生型外，粒細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞的增加水平都弱于野生型，而且E.coli較長(zhǎng)時(shí)間存在于血管以及動(dòng)靜脈之間。在pu.1突變體或是pu.1 MO幼魚中感染E.coli后，斑馬魚幼魚的HSPC是明顯減少的，其原因是在 pu.1 MO幼魚中cmyb+HSPC凋亡的細(xì)胞明顯增多，而其增殖細(xì)胞沒有發(fā)生變化。由此可見，雖然Pu.1在髓系應(yīng)急性造血中沒有起到至關(guān)重要的作用，但對(duì)髓系細(xì)胞的

9、成熟以及維持HSPC的體內(nèi)平衡卻是必不可少的。
　　在本研究中，我們通過靜脈注射非致死的細(xì)菌（大腸桿菌，E.coli）引起系統(tǒng)性感染，進(jìn)而仔細(xì)觀察CHT部位的吞噬細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞）以及他們的前體細(xì)胞甚至HSPC的變化情況。結(jié)果顯示，髓系吞噬細(xì)胞會(huì)立即做出反應(yīng)來應(yīng)對(duì)E.coli，在注射后6小時(shí)（6hpi）吞噬細(xì)胞會(huì)有所消耗，但隨后會(huì)逐漸增多，在注射后2-4天（2-4dpi）會(huì)達(dá)到峰值，然后恢復(fù)至生理水平。與此同時(shí)，免疫反應(yīng)相關(guān)