納米氧化鋁引起裸耐藥基因轉(zhuǎn)移至大腸桿菌K12及其機(jī)制研究.pdf

1、納米材料的污染和耐藥基因的擴(kuò)散正日益成為全球公共健康的威脅。當(dāng)納米材料和耐藥基因（antibiotic resistance genes，ARGs）相遇，它們會(huì)如何相互作用？納米材料是否能夠協(xié)助死亡菌體釋放的耐藥基因進(jìn)入活的菌體細(xì)胞從而引起耐藥基因的擴(kuò)散？
　　本項(xiàng)目采用抗性篩選法研究不同尺寸、不同濃度氧化物對(duì)不同濃度、不同種類耐藥基因水平轉(zhuǎn)移入不同菌株細(xì)胞的影響。結(jié)果表明納米氧化物顆粒，特別是納米氧化鋁（nano-Al2O3）能

2、夠促進(jìn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。與大腸桿菌K12相比，大腸桿菌HB101是一種易于耐藥基因轉(zhuǎn)化的菌株，能夠攝入更多的耐藥質(zhì)粒，所以我們推斷轉(zhuǎn)化是納米顆粒促進(jìn)耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的方式之一。同時(shí)，這種促轉(zhuǎn)移作用與耐藥質(zhì)粒和納米顆粒的結(jié)合有關(guān)，所以納米顆粒可能載帶耐藥質(zhì)粒進(jìn)入菌體細(xì)胞，然后緩慢釋放。
　　本文證明納米氧化鋁能夠顯著促進(jìn)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)化，包括進(jìn)入革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌（質(zhì)粒需修飾），而尺寸大的氧化鋁顆粒

3、無(wú)此作用。在適宜條件下菌體細(xì)胞與納米氧化鋁相互作用，每100 ng耐藥質(zhì)粒能夠獲得7.4×106個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，或者2.9×105個(gè)金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化子。
　　納米顆粒的濃度、質(zhì)粒濃度、菌體細(xì)胞數(shù)目、材料與菌體細(xì)胞的作用時(shí)間、渦旋混勻時(shí)間等因素都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。我們進(jìn)一步探討了現(xiàn)象背后的機(jī)制。
　　通過(guò)原位雜交和掃描電鏡觀察，結(jié)果表明納米氧化鋁可損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，致其產(chǎn)生孔洞，耐藥基因可通過(guò)孔洞進(jìn)入細(xì)胞。活性氧自由基（rea

4、ctive oxygen species，ROS）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果表明內(nèi)源性活性氧自由基可能損傷細(xì)胞膜，SOS（Save Our Ship，SOS）應(yīng)答促進(jìn)了耐藥基因的轉(zhuǎn)化。
　　抗生素的濫用使環(huán)境中耐藥基因和耐藥菌大規(guī)模爆發(fā)，帶來(lái)了人和動(dòng)物的公共健康問(wèn)題。我們的前期研究結(jié)果表明在我國(guó)主要河流中不僅能檢測(cè)到天然的耐藥基因，也發(fā)現(xiàn)了人工合成的耐藥基因。研究表明：在水中納米顆粒能夠顯著促進(jìn)質(zhì)粒R

5、P4、RK2、pCF10介導(dǎo)的耐藥基因接合轉(zhuǎn)移。本研究證實(shí)納米顆粒通過(guò)結(jié)合和致密壓縮耐藥基因從而保護(hù)其抵抗核酸酶Hind III、Hinc II、Sal I、Sty I、Nco I、Nde I和DNase I的降解，并作為載體參與耐藥基因的轉(zhuǎn)移。這種結(jié)合與納米顆粒的濃度、兩者作用時(shí)間、離子種類和濃度有關(guān)?；诩t外光譜、紫外光譜和原子力顯微鏡分析，我們推測(cè)納米氧化鋁幫助耐藥基因抗酶解的機(jī)制為：納米顆粒導(dǎo)致的致密壓縮改變了耐藥基因分子的結(jié)構(gòu)

6、。
　　在緊密結(jié)合在一起抗酶解的同時(shí)，氧化鋁納米顆粒能夠載帶耐藥質(zhì)粒進(jìn)入菌體細(xì)胞。本研究首次發(fā)現(xiàn)納米氧化鋁顆粒的這種載帶功能，我們稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛐酒D(zhuǎn)錄組分析和實(shí)時(shí)定量PCR探討了其分子機(jī)制。在合適條件下菌體細(xì)胞與nano-Al2O3-pBR322復(fù)合物相互作用，每100 ng耐藥質(zhì)粒能夠獲得3.5×104個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。與納米氧化鋁結(jié)合的耐藥質(zhì)粒越多，耐藥基因的轉(zhuǎn)移率就越高。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的分子機(jī)制可能為：納米氧化鋁載帶耐藥質(zhì)?？?/p>

7、膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，引起細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，抑制關(guān)鍵的代謝基因rdgB、glyA、pgm、accC、deoD、pgi、aspC等的表達(dá)，為細(xì)胞節(jié)省能量和物質(zhì)。上調(diào)polB、recN、ruvA、uvrB、uvrD、dinG等SOS應(yīng)答基因，促進(jìn)耐藥基因的復(fù)制與表達(dá)。
　　氧化物特別是氧化鋁納米顆粒能夠通過(guò)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)方式促進(jìn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能為氧化損傷。采用數(shù)學(xué)模型分析了不同方式在不同時(shí)間點(diǎn)的比重變化，結(jié)果表明隨著納米顆粒與細(xì)胞作用時(shí)間的