大腸埃希氏菌K12外膜蛋白耐藥蛋白質(zhì)組及其調(diào)節(jié)新機制的研究.pdf

1、抗生素的發(fā)現(xiàn)與臨床應(yīng)用使很多危害人類的感染性疾病得到控制，對提高人們的生活質(zhì)量起到重要的作用。但隨著抗生素的廣泛使用，抗生素濫用不可避免地在全世界范圍內(nèi)發(fā)生，由此導(dǎo)致細菌的耐藥性出現(xiàn)，并日益嚴(yán)重，直接威脅到人類的生命健康。因此，闡明細菌耐藥感染機制對耐藥菌的控制具有十分重要的意義。在目前己知的4個抗生素耐藥機制中，膜通透性與外排泵系統(tǒng)機制是與多重耐藥相關(guān)的2個重要因素。膜通透性降低可以阻止抗生素進入，外排泵的啟動則將胞內(nèi)抗生素外排到胞外

2、。革蘭氏陰性細菌外膜蛋白是細胞膜通透性與外排泵系統(tǒng)的直接承擔(dān)者，在細菌耐藥中具有重要的作用，因此研究其在耐藥中的調(diào)控與機制具有重要的意義。 本試驗首先采用功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以對具有代表性的6種抗生素：萘啶酮酸(NA，第一代喹諾酮類)、金霉素(CTC，第一代四環(huán)素類)、巴洛沙星和環(huán)丙沙星(BLFX，CFLX，第三代氟喹諾酮類)、頭孢他啶和頭孢曲松鈉(CTRX，CAZ，第三代頭孢菌素類)的大腸埃希氏菌傳代耐藥菌株為研究對象，對這6

3、種傳代耐藥菌株外膜差異蛋白進行了較系統(tǒng)的鑒定和較深入的比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與這些細菌耐藥相關(guān)外膜蛋白為TolC、LamB、OmpC、OmpF、OmpT、FadL、OmpW、FhuA、FecA、Ag43和YaeT等11個，這些變化蛋白在不同的抗生素傳代耐藥菌中的變化并不一樣。其中LamB在金霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶和頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)，F(xiàn)ecA在環(huán)丙沙星、巴洛沙星、頭孢他啶和頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)，F(xiàn)huA在頭孢曲松鈉

4、傳達耐藥菌中表達下調(diào)，F(xiàn)adL在金霉素和萘啶酮酸傳代耐藥菌中表達下調(diào)，Ag43在環(huán)丙沙星和頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)，YaeT在頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)。OmpF、OmpC、TolC、OmpT和OmpW在不同抗生素耐藥中的表達不一樣，其中OmpF在環(huán)丙沙星和頭孢他啶中表達下調(diào)，而在頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達升高，OmpC在萘啶酮酸傳代耐藥菌株中表達升高、但在金霉素、頭孢他啶和頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)，TolC在頭孢曲松鈉

5、傳代耐藥菌中表達下調(diào)，而在其它抗生素耐藥傳代菌中表達上調(diào)，OmpT在萘啶酮酸代耐藥菌中表達上調(diào)，而在金霉素和頭孢曲松鈉耐藥傳代菌中表達下調(diào)。OmpW在萘啶酮酸傳代耐藥菌中表達上調(diào)，而在金霉素、環(huán)丙沙星和頭孢他啶傳代耐藥菌中表達下調(diào)。 這些變化的外膜蛋白中，Ag43、YaeT和FecA在耐藥中的變化以前未見報道，是本試驗新報道的與耐藥相關(guān)蛋白。TolC、OmpC、OmpF、LanB、OmpT、FadL和FhuA在抗生素中表達變化已

6、有文獻報道，但是TolC在以往文獻中的報道都是表達上升，而在本試驗中，首次發(fā)現(xiàn)TolC的蛋白修飾點在不同抗生素耐藥中的變化不一樣，并首次報道在頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達下調(diào)。OmpC在以往文獻中的報道都是表達下降，而在本試驗中，首次發(fā)現(xiàn)OmpC在萘啶酮酸傳代耐藥菌中表達上升。在不同細菌耐藥中，文獻報道LamB的表達變化不一樣，而在本試驗中，LamB在金霉素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶和頭孢曲松鈉傳代耐藥菌中表達都是下調(diào)。FadL和文獻報道的變化

7、一致，都是下調(diào)。OmpT和OmpW在以往的報道中表達變化不一致，在本試驗中，OmpT和OmpW的變化在不同抗生素傳代耐藥菌中的表達也不一樣。關(guān)于FhuA的文獻報道并沒有談及耐藥中該蛋白的表達情況，在本試驗中，F(xiàn)huA的表達下降，與預(yù)測的變化一致。 接下來以金霉素和萘啶酮酸為例，通過其耐藥相關(guān)的外膜蛋白缺失菌株對在不同金霉素和萘啶酮酸濃度下生存率試驗，比較這些外膜蛋白在細菌耐藥中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TolC、OmpC、OmpF和La

8、mB在萘啶酮酸和金霉素耐藥中起重要作用。進一步比較這4種缺失菌株對其他4種抗生素中的生存率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為多重耐藥的通用外排泵蛋白TolC對頭孢類抗生素不起作用，LamB在抗生素耐藥中起重要的負調(diào)作用，OmpC和OmpF的表達變化涉及到不同的調(diào)控系統(tǒng)，與抗生素的種類有關(guān)。 接下來對在耐藥中具有重要功能的LamB和OmpC與OmpF的耐藥機理與調(diào)節(jié)機制進行較深入的研究： (1)已知OmpC與OmpF受雙組分調(diào)控系統(tǒng)O

9、mpR/EnvZ和CpxA/CpxR的調(diào)節(jié)，但其在細菌耐藥中的調(diào)節(jié)方式還不清楚。本實驗首先通過Western blotting方法比較分析在萘啶酮酸和金霉素作用下，OmpC與OmpF在這2個雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因缺失菌株中表達的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在金霉素作用下，OmpR/EnvZ與CpxR/CpxA都對OmpC與OmpF起調(diào)控的作用，但是主要是以CpxR/CpxA系統(tǒng)為主。在萘啶酮酸作用下，OmpC與OmpF的變化主要受OmpR/EnvZ系

10、統(tǒng)的調(diào)控，CpxA可能對OmpR具有交叉調(diào)控的作用。然后利用雙向電泳技術(shù)分析OmpR/EnvZ和CpxR/CpxA缺失菌株在高濃度金霉素和萘啶酮酸作用下，細菌外膜蛋白的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有18個表達差異蛋白，其中有14個是外膜蛋白(YaeT、FecA、TolC、OmpT、OmpC、FhuA、Ag43、NmpC、OmpW、FliC、ButB、OmpF、PhoE和OmpA)，這14個外膜蛋白中有9個是在6種抗生素傳代耐藥菌株發(fā)生變化的外膜蛋

11、白(TolC、FecA、FhuA，OmpW、YaeT、OmpF、OmpC、OmpT和Ag43)，5個外膜蛋白(OmpA、NmpC、FliC、PhoE和ButB)是新發(fā)現(xiàn)的差異蛋白。這些蛋白在抗生素作用下的表達變化，很可能形成蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)，是對耐藥重要蛋白OmpC和OmpF變化的補償。最后，利用蛋白相互作用分析軟件，建立表達差異的外膜蛋白之間相互變化網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失ompR后蛋白的變化以正調(diào)控為主，而缺失cpxA后，外膜蛋白的變

12、化主要以負調(diào)控為主。這兩個雙調(diào)節(jié)系統(tǒng)對兩種抗生素的調(diào)節(jié)差別可能主要在于，通過CpxR對AtpB的調(diào)節(jié)不同而影響OmpC的變化，從而構(gòu)成耐藥調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)差異。認識這些耐藥相關(guān)外膜蛋白在不同抗生素中的變化方式，對指導(dǎo)臨床用藥具有重要的意義。 (2)為研究LamB在細菌耐藥中的功能及其耐藥機制，本試驗首先通過熒光光度法研究缺失lamB菌株在金霉素中的積聚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失lamB導(dǎo)致金霉素濃度在細菌體內(nèi)積聚的降低，提示LamB很可能起抗生

13、素通道的功能。然后利用Western blotting以及Co—IP試驗尋找LamB的相互作用蛋白并分析其在細菌耐藥中的表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LamB與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHc)中的E1酶部分Odp1形成復(fù)合物，并且LamB—Odp1復(fù)合物隨著耐藥細菌的抗性增強而降低，這提示LamB—Odp1介導(dǎo)的細菌耐藥與細菌能量系統(tǒng)相關(guān)。隨后利用Western blotting及在金霉素中生存率變化的方法篩選與LamB表達相關(guān)的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，試驗發(fā)

14、現(xiàn)，LamB的表達受BasS/BasR、BarA/UvrY和BaeS/BaeR的調(diào)控，△ basS與△ uvrY在金霉素作用下的生存率升高，提示雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)LamB的表達，并與細菌耐藥過程相關(guān)。進一步通過雙向電泳的方法比較缺失lamB菌株在金霉素作用下蛋白的表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lamB的缺失在金霉素作用下導(dǎo)致AtpA、AtpB、PtnaB、TolB、MalK、YncD、EftU、PhsA和ButB的變化，它們涉及生長因子、大腸桿菌

15、素、能量系統(tǒng)和糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的變化，提示與LamB相關(guān)的細菌耐藥過程涉及廣泛的細菌體內(nèi)多個能量及代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。最后通過Western blotting的方法分析LamB在臨床耐藥菌株中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，至少有60％的臨床耐藥菌株中LamB發(fā)生明顯的下降，因此LamB在耐藥中的負調(diào)是普遍的現(xiàn)象。根據(jù)對LamB的耐藥功能及其耐藥機制的研究，提示LamB介導(dǎo)的細菌耐藥途徑是一個新的耐藥機制。 通過以上的研究，為進一步研究細菌耐藥機制做