斑馬魚虹彩病毒感染模型的建立及免疫相關(guān)分子研究.pdf

1、本論文借助一系列的實驗動物學(xué)，免疫學(xué)，病理學(xué)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法成功建立斑馬魚-ISKNV感染模型，并通過差減文庫的方法找到一系列的免疫，病理相關(guān)基因，為揭示低等生物抗病毒免疫機制的研究奠定基礎(chǔ)和提供必要的平臺。同時作為低等生物的代表，本論文還就斑馬魚中LPS耐受問題及LPS識別分子TLR4功能進(jìn)行了初步驗證。 1，本論文成功的建立斑馬魚-傳染性脾臟腎臟壞死病病毒(infectious spleenand kidney

2、necrosis virus，ISKNV)感染模型，并進(jìn)行一系列的鑒定工作。發(fā)現(xiàn)斑馬魚感染ISKNV后出現(xiàn)以全身性出血，豎鱗及脾臟腫大為特征的典型的臨床癥狀，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)明顯的貧血癥狀。免疫組織化學(xué)及免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)病毒能夠感染斑馬魚多個組織器官，但病毒信號并不位于組織特異性細(xì)胞，提示病毒宿主細(xì)胞可能為問質(zhì)細(xì)胞。同時比較發(fā)現(xiàn)感染斑馬魚自身不同組織內(nèi)病毒表現(xiàn)有所不同，具體為病毒感染能力的相似性及病毒增殖能力的差異，與感染鱖魚比較發(fā)現(xiàn)

3、感染斑馬魚中病毒沒有表現(xiàn)任何形式的細(xì)胞外釋放，而在感染鱖魚中則完全相反病毒大部分已釋放到感染細(xì)胞外，病毒在斑馬魚傳代過程中，這種釋放抑制的情況有所改觀；流式細(xì)胞及real—time RT-PCR檢測顯示斑馬魚淋巴細(xì)胞有所增加，經(jīng)典的免疫相關(guān)分子幾乎沒有任何變化，提示斑馬魚可能采取不同的策略清除病毒。 2，成功建立斑馬魚不同病毒來源，不同組織，不同感染時間的5個差減cDNA文庫，排查出大量免疫相關(guān)，病理相關(guān)的基因，揭示病毒感染后

4、斑馬魚免疫學(xué)，病理學(xué)的變化，推測其可能采取的免疫學(xué)機制。具體基因主要分三個部分，一是免疫相關(guān)基因，二是凋亡相關(guān)基因，三是腫瘤相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)斑馬魚-ISKNV中可能通過NF-?B活性抑制從而抑制經(jīng)典抗病毒分子的表達(dá)，在斑馬魚-ISKNV中發(fā)現(xiàn)大量持續(xù)表達(dá)的急性期反應(yīng)蛋白和凝集素分子，同時也發(fā)現(xiàn)體液免疫分子lg及細(xì)胞免疫效應(yīng)分子穿孔素的上調(diào)，免疫信號通路分子MAPK及ERK分子；凋亡相關(guān)基因相關(guān)基因主要為細(xì)胞色素C氧化酶，easpase a

5、及caspase 8等并通過實驗方法驗證在斑馬魚感染ISKNV后大量凋亡現(xiàn)象的出現(xiàn)。腫瘤相關(guān)基因主要為Ras原癌基因家族，可能參與Ras-MAPK-ERK．通路激活。 3，對低等生物L(fēng)PS不敏感問題進(jìn)行初步探討，發(fā)現(xiàn)斑馬魚面對高劑量LPS刺激同樣表現(xiàn)為耐受，斑馬魚LPS受體分子TLR4主要在血液中表達(dá)，并且LPS能夠引起其上調(diào)表達(dá)，同時還發(fā)現(xiàn)斑馬魚TLR4a，TLR4b不同細(xì)菌來源LPS的反應(yīng)性有所不同，與其他生物TLR4基因進(jìn)