淫羊藿苷對(duì)多發(fā)性硬化患者PBMC ER mRNA表達(dá)及炎癥因子的影響.pdf

1、研究背景：
　　多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)慢性炎性脫髓鞘疾病，由遺傳易感性、環(huán)境因素、病毒感染等多種因素共同作用誘發(fā)。其癥狀復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為時(shí)間和空間的多發(fā)性，大部分患者具有緩解-復(fù)發(fā)的病程，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺、精神和認(rèn)知障礙，呈進(jìn)行性加重。大量研究表明，MS的發(fā)病與外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood

2、 mononuclear cell，PBMC）中Th1/Th2之間的功能失衡有密切關(guān)系，Th1型細(xì)胞分泌IL-12、INF-γ等致炎細(xì)胞因子促進(jìn)MS發(fā)展，Th2型細(xì)胞分泌IL-4、IL-10等抗炎細(xì)胞因子緩解MS病情。循證醫(yī)學(xué)A級(jí)推薦使用皮質(zhì)類固醇激素作為急性發(fā)作和復(fù)發(fā)MS的治療，大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療可縮短急性發(fā)作期病程，但不能阻止其復(fù)發(fā)，且具有骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死、上消化道出血等嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)外研究表明，雌激素對(duì)MS和實(shí)

3、驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)具有保護(hù)作用，但存在誘發(fā)生殖系統(tǒng)腫瘤、血栓性疾病等風(fēng)險(xiǎn)，而淫羊藿苷（icariin,ICA）——一種植物雌激素，有明確雌激素樣作用并能調(diào)控體內(nèi)雌激素水平的藥物，在骨質(zhì)疏松、心血管疾病方面具有肯定療效。在我們前期相關(guān)研究中，已證實(shí)ICA通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性雌激素水平、雌激素受體（ estrogen receoter，ER）介導(dǎo)、增

4、加腦組織糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）表達(dá)水平及減少與Th1有關(guān)的細(xì)胞因子、升高與Th2有關(guān)的細(xì)胞因子水平途徑對(duì)EAE起神經(jīng)保護(hù)作用。本研究基于前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探索ICA對(duì)MS患者體外炎癥因子影響。
　　研究目的：
　　制備ICA含藥血清，從MS患者外周血中分離提取PBMC，PBMC在植物血球凝集素（ phytohemagglutinin，PHA)刺激作用下，加入不同劑量ICA

5、含藥血清，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ-PCR）檢測(cè)ICA含藥血清作用后PBMC中GR、ERα、ERβmRNA表達(dá)水平變化，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）對(duì)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-4、IL-17進(jìn)行檢測(cè)。探討ICA對(duì)MS患者體外炎癥因子水平影響及劑量與療效關(guān)系。
　　研究對(duì)象和方法：
　　1.研

6、究對(duì)象
　　納入研究的10例患者均為急性期MS，診斷符合2010年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫性疾病、顱內(nèi)外感染性疾病、腫瘤、近3個(gè)月接受過(guò)免疫抑制治療者；健康人組選擇年齡、性別基本匹配的健康志愿者，共10例。
　　2.研究方法
　　2.1.制備ICA含藥血清和空白血清
　　取成年雄性SD大鼠,按每克體重0.25mg ICA計(jì)算給藥量，采用3次給藥法，每次給藥量相等，首次給藥和第二次給藥相隔時(shí)間為

7、20h，第二次和第三次給藥時(shí)間相隔4h，末次給藥后一個(gè)小時(shí)腹主動(dòng)脈采血，靜置30min后離心，取上清過(guò)濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆?。以相同體積的羧甲基纖維素鈉制得空白血清。
　　2.2.PBMC的分離、提取
　　①采集MS患者及健康人空腹靜脈血20ml，肝素抗凝備用。
　?、趥浜玫目鼓昧馨图?xì)胞分離液行Ficoll-Paque密度梯度離心分離、提取PBMC。
　?、奂?xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞使其濃度為106/ ml。

8、r>　?、軝z測(cè)細(xì)胞活力。
　　2.3.PBMC分組及培養(yǎng)
　?、貾BMC懸液中加PHA5ug/ml。把細(xì)胞懸液混勻，平均分成8組移至培養(yǎng)板，分別予以相應(yīng)處理。健康人組及MS患者組均分為A0、B0、C0、D0、A1、B1、C1、D18組,A0組為2.5％空白血清對(duì)照組、B0組為5%空白血清對(duì)照組、C0組為10%空白血清對(duì)照組、D0組空白對(duì)照組，A1為2.5%含ICA血清小劑量組、B1組5%含ICA血清中劑量組、C1組10%含I

9、CA血清大劑量組，D1組35ug/L雌激素組。
　?、谥糜?7℃、5%CO2孵箱中，分別于48、72小時(shí)后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、活化情況。
　?、叟囵B(yǎng)72h后將PBMC的培養(yǎng)液取出，離心，收集上清及細(xì)胞沉淀，于-80℃保存
　　2.4.各組免疫因子檢測(cè)
　　各組培養(yǎng)上清IL-4、IL-17的檢測(cè)：嚴(yán)格按照IL-4、IL-17 ELISA試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作、檢測(cè)。
　　2.5.各組PBMC中GR

10、、ERα、ERβmRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　以RQ-PCR方法檢測(cè)PBMC中GR、ERα、ERβmRNA的表達(dá)。
　　2.6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism5進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。RQ-PCR結(jié)果采用ΔCt法分析，基因相對(duì)表達(dá)量RQ=2-ΔΔCt。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.各組上清液中IL-4的含量
　　①與各自對(duì)照組

11、比較，MS患者各組IL-4水平均有升高，其中中、大劑量ICA組及雌激素組升高有顯著意義(P＜0.05)，而小劑量 ICA組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　②健康人各組IL-4水平下降，其中大劑量ICA組(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組(P＞0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、跧L-4濃度差值比較：MS患者中、大劑量ICA組、雌激素組與各自對(duì)照組IL-4濃度差，三組兩兩比較（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組 IL-

12、4升高的幅度相當(dāng)。
　?、躆S患者與健康人的ICA組與各自對(duì)照組IL-4濃度差值比較：小劑量ICA組（P=0.0147，P＜0.05），MS患者小ICA組IL-4升高水平較健康人明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、大劑量ICA組（P=0.0025、P=0.0004，P＜0.01），MS患者中大ICA組IL-4升高水平較健康人明顯，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著ICA劑量增大，MS患者IL-4升高幅度較健康人的越明顯。
　　2.各組上清液中IL-

13、17的含量
　?、倥c各自對(duì)照組比較，MS患者各組IL-17水平均有下降，其中中劑量ICA組IL-17下降(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大劑量ICA組及雌激素組下降(P=0.001、P=0.009，P＜0.01)，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小劑量ICA下降(P＞0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、谂c各自對(duì)照組比較，健康人各組IL-17水平無(wú)明顯變化，各組(P＞0.05)，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、跧L-17濃度差值比較：MS患者中

14、、大劑量ICA組、雌激素組與各自對(duì)照組IL-17濃度差，三組兩兩比較（P＞0.05），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但大劑量組 IL-17下降幅度較中劑量組明顯，與雌激素組相同。
　?、躆S患者與健康人的ICA組與各自對(duì)照組IL-17濃度差值比較：MS患者小、中、大劑量ICA組IL-17下降幅度差異較健康人，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但I(xiàn)CA劑量越大，降低MS患者外周血IL-17的濃度作用較健康人越明顯，呈劑量依賴性。
　　3.各組PBMC GR mR

15、NA表達(dá)水平
　　健康人和MS患者中各組GR mRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ICA對(duì)PBMC GR mRNA表達(dá)無(wú)影響作用。
　　4.各組PBMC ERαmRNA表達(dá)水平
　?、倥c各自對(duì)照組比較，MS患者中、大劑量ICA及雌激素組ERα mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而小劑量組無(wú)明顯差異；中、大劑量ICA組和雌激素組，三組間兩兩比較，P＞0.05，無(wú)

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、谂c各自對(duì)照組比較，健康人各組ERα mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.各組PBMC ERβmRNA表達(dá)水平
　?、倥c各自對(duì)照組比較，MS患者大劑量ICA及雌激素組ERβmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而中、小劑量組無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?、谂c各自對(duì)照組比較，健康人各組ERβmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異，差

17、異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.ICA可以提高M(jìn)S患者PBMC的ERα、ERβmRNA的表達(dá)，具有擬雌激素樣作用。
　　2.ICA對(duì)MS患者PBMC的GR mRNA的表達(dá)無(wú)明顯干預(yù)作用。
　　3.ICA通過(guò)擬雌激素樣作用，降低MS患者PBMC培養(yǎng)上清液 IL-17水平，減輕炎癥反應(yīng)，且呈ICA劑量依賴性。
　　4.ICA通過(guò)擬雌激素樣作用，提高M(jìn)S患者PBMC培養(yǎng)上清 IL-4水平，減