山羊B細(xì)胞刺激因子(gBAFF)及γ-INF誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(gGILT)的克隆、表達(dá)及生物學(xué)功能的研究.pdf

1、本論文共分為3個(gè)部分：
　　第一部分:綜述B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)以及γ-IFN誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)的研究進(jìn)展；
　　第二部分:山羊B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)的克隆、表達(dá)和生物活性研究。BAFF是TNF家族的重要成員，對(duì)B細(xì)胞的分化和存活起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)RT-PCR法，從山羊脾臟組織中擴(kuò)增得到843bp的goatBAFF基因(簡(jiǎn)稱gBAFF)。gBAFF的開(kāi)放讀碼框(ORF)由280個(gè)氨基

2、酸組成，其中胞外可溶段包含152個(gè)氨基酸，其氨基酸序列擁有TNF特征：跨膜區(qū)、潛在的弗林酶切位點(diǎn)和三個(gè)半胱氨酸殘基。預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)顯示，gBAFF與人、鼠等的BAFF結(jié)構(gòu)相似。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明gBAFF主要在淋巴組織脾臟中表達(dá)。為了增強(qiáng)目的蛋白的可溶性，我們?cè)贐L21(DE3)中表達(dá)了用pSUMO載體構(gòu)建的gsBAFF重組蛋白(SUMO-gsBAFF)，隨后經(jīng)鎳柱親和層析得到純化的重組蛋白，并進(jìn)行了SDS PAGE和western

3、 blot分析。體外MTT檢測(cè)和流式細(xì)胞分析表明：SUMO-gsBAFF能夠促進(jìn)山羊淋巴細(xì)胞的存活；SUMO-gsBAFF和anti-IgM共刺激能夠促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的存活。這些結(jié)果暗示，BAFF能夠作為一個(gè)潛在的免疫因子增強(qiáng)山羊免疫系統(tǒng)的功能。
　　第三部分:山羊GILT的克隆、表達(dá)和活性研究。干擾素-γ，誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)對(duì)MHCⅡ抗原呈遞過(guò)程中的二硫鍵還原起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR法，從山羊脾

4、臟中擴(kuò)增得到山羊GILT基因(簡(jiǎn)稱gGILT)。gGILT由244個(gè)氨基酸組成，分子量約為27.6 kDa，并且擁有GILT蛋白的特征性結(jié)構(gòu)序列：CXXC基序CQHGX2ECX2NX4C和5個(gè)半胱氨酸殘基。在氨基酸水平上，gGILT與牛GILT的相似性高達(dá)93.03％。系統(tǒng)進(jìn)化分析也顯示gGILT與牛GILT的同源性最高。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，gGILT的表達(dá)具有組織特異性，并且經(jīng)過(guò)LPS刺激后，其在淋巴細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)量