七鰓鰻過氧化物還原酶2(Peroxiredoxin2)基因克隆、表達及生物學活性研究.pdf

1、過氧化物還原酶(Peroxiredoxin,Prx)是在生物體中廣泛表達的一類新的抗氧化蛋白家族,在進化上高度保守,參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導、增殖、分化、凋亡及免疫細胞毒等進程,對于生物體維持正常生命活動起關鍵作用。七鰓鰻作為脊椎動物最直接的祖先,在進化上因連接著脊椎與無脊椎動物而具有極高的研究價值,為深入探索脊椎動物的起源與進化提供了豐富的遺傳信息。目前關于Prx的研究多集中在硬骨魚及哺乳動物,七鰓鰻中是否存在Prx尚不明確。本論文利用

2、分子生物學手段和生物信息學方法,從現(xiàn)存最古老的無頜類脊椎動物七鰓鰻(Lampetra japonica)口腔腺cDNA文庫中搜索到一條Prx2同系物,對其基因進行克隆、進化和表達分析,可以揭示七鰓鰻Prx2基因與無脊椎動物和脊椎動物Prx2基因間的進化關系,有助于從分子水平上闡述脊椎動物Prx家族的起源和進化；此外,七鰓鰻口腔腺因分泌抗凝血劑、抗腫瘤劑以及麻醉劑而得到廣泛關注,而七鰓鰻口腔腺分泌Prx2過氧化物酶活性的確定,使其有望成為

3、潛在的抗氧化制劑,同時為進一步闡釋七鰓鰻特有的寄生生活習性提供了理論依據(jù)。
　　 本研究通過對日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫1300多條有效EST序列進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)一條能夠翻譯Prx2模體的開放閱讀框,長594 bp,編碼197個氨基酸,理論分子量21.7 kDa。具有典型的2-Cys Prx的兩個氧化還原活性的半胱氨酸殘基,且活性半胱氨酸殘基周圍保守模體分別為FFYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA。七鰓鰻Prx2

4、不含有信號肽和跨膜區(qū)。在氨基酸水平上,與脊椎動物Prx1和Prx2均具有70％以上的序列相似性。為了進一步說明七鰓鰻Prx2與Prx1和Prx2亞族的關系,構建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Prx2與脊椎動物Prx2亞族構成一簇,而與Prx1亞族親緣關系較遠,說明克隆到的七鰓鰻Prx同系物屬于Prx2亞族；此外,對七鰓鰻Prx2進化地位進行分析,發(fā)現(xiàn)七鰓鰻Prx2進化地位比較原始,與硬骨魚Prx2親緣關系較近,符合生物由低等到高等的

5、客觀自然進化規(guī)律。
　　 利用基因工程手段,設計特異性引物,以GAPDH作為內(nèi)參基因,Real-time PCR法檢測Prx2 mRNA在七鰓鰻口腔腺、心臟、肝臟、腎臟、鰓、腸、紅細胞和白細胞中的相對表達量,發(fā)現(xiàn)Prx2在七鰓鰻上述組織中廣泛表達,且在紅細胞中高豐度表達,進一步經(jīng)脂多糖(LPS)刺激后,Prx2在紅細胞中的表達量明顯上調(diào),具有統(tǒng)計學意義。以上結果說明Prx2與七鰓鰻紅細胞抗氧化防御密切相關,對保護紅細胞免受活性氧

6、自由基的氧化損傷起重要作用；此外,Prx2在清除病原菌的防御反應中也發(fā)揮至關重要的作用。
　　 進一步構建pET23b-Prx2原核表達載體,并在E.coli BL21中進行表達,組氨酸親和層析柱純化,獲取七鰓鰻Prx2重組蛋白(recombinant L.japonica Prx2,rLj-Prx2)純品。以純化的重組蛋白為抗原免疫新西蘭兔,制備兔抗七鰓鰻血清Prx2蛋白多克隆抗體。對日本七鰓鰻口腔腺進行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)Pr

7、x2在七鰓鰻口腔腺的陽性表達區(qū)主要集中在上皮細胞和致密結締組織細胞中。免疫印跡法進一步檢測,發(fā)現(xiàn)自行制備的多克隆抗體能夠與口腔腺天然分泌產(chǎn)物和重組蛋白均發(fā)生明顯的特異性結合,說明Prx2蛋白不僅存在于口腔腺細胞中,同時也能被分泌到胞外,雖不含信號肽,卻是一種分泌蛋白。這對于維持其特殊的寄生生活方式起重要作用,能夠更好地抵抗來自宿主免疫防御系統(tǒng)和代謝過程中產(chǎn)生活性氧的攻擊,形成保護機體免受氧化劑損傷的天然屏障。
　　 對rLj-P

8、rx2進行了體外過氧化物酶活性的檢測。研究表明,rLj-Prx2有還原H2O2的解毒能力,且還原能力與重組蛋白的濃度成正比。同時這種還原活性是硫醇類物質依賴的,當反應體系中存在二硫蘇糖醇(DTT)時,DTT作為供氫體將被氧化的rLj-Prx2還原,使之重新具有抗氧化生物學活性。進一步進行了DNA缺刻分析,構建DTT/Fe3+/O2混合功能氧化酶體系,發(fā)現(xiàn)在一些自由基如羥自由基對DNA造成損傷時,rLj-Prx2對超螺旋DNA也具有一定程