未培養(yǎng)海洋微生物延胡索酸還原酶的基因克隆、表達(dá)及生化性質(zhì)鑒定.pdf

1、延胡索酸還原酶(fumarate reductase，EC1.3.1.6)，主要催化延胡索酸還原生成琥珀酸，是很多生物厭氧呼吸系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。該酶廣泛存在于革蘭氏陰性菌、兼性厭氧革蘭氏陽性菌以及一些綠藻、原生動物、寄生蠕蟲和低等海洋等真核生物中。不僅可應(yīng)用于多種人類疾病治療，且其產(chǎn)物琥珀酸也有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價值。本研究主要研究了從廣西北部灣海洋微生物宏基因組文庫中得到的一個具有延胡索酸還原酶功能的陽性克隆(pGXAR313G)，其攜帶的

2、外源DNA片段包含一個可能編碼延胡索酸還原酶的新基因，該基因被命名為frd1A。
　　 通過生物信息學(xué)分析表明，frd1A基因含有444個堿基對，編碼147個氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.59，相對分子質(zhì)量為16.11 kDa。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，在核苷酸水平上沒有發(fā)現(xiàn)已知的基因存在相似性，但是在氨基酸水平卻與一種延胡索酸還原酶(Runellaslithyformis YP_004658175)的B亞基相似性為82%，一致

3、性為69%。在第56-64個氨基酸中，有一個2Fe-2S鐵氧還蛋白結(jié)合位點(diǎn)，推測是其保守結(jié)構(gòu)域。
　　 利用DNA重組技術(shù)，將frd1A基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pETBlue-2重組后導(dǎo)入到Escherichia coli Tuner(DE3)pLacI細(xì)胞中，得到重組表達(dá)菌株E.coli Tuner(DE3)pLacI/pGXAR313G。并在最適條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到重組產(chǎn)物蛋白Frd1A，利用鎳柱親和層析技術(shù)完成了重組蛋白的分離純

4、化，完成了重組蛋白的功能鑒定和生化性質(zhì)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白的最適反應(yīng)溫度為28℃，最適作用pH為7.0；最適條件下的酶活力為9.59 U/mL，比活力為10.644 U/mg。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，測得其Km值為0.227 mM，Vmax為29.94 mM/min，kcat值為12.35 s-1；Zn2+、Mg2+對酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、SDS和EDTA則表現(xiàn)為抑制作