趨磁菌AMB-1超氧化物歧化酶基因的克隆表達及不同還原劑下菌體生長和磁小體合成的研究.pdf

1、趨磁菌Magnetospirillum AMB-1產(chǎn)生的磁小體是一種晶型完美、單分散性、生物性能良好的納米級Fe3O4型磁性微球，其粒徑分布在50-100nm，磁學特性與通過化學合成的磁性微球相當。磁小體作為一種有待于開發(fā)利用的磁性納米材料，現(xiàn)已在醫(yī)學、生物學、電子學以及航天工業(yè)有所應用。目前，在通過培養(yǎng)條件優(yōu)化方法來提高AMB-1生長密度及增強磁小體合成能力的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度是一個重要因素：氧氣濃度太高或太低會對菌體生長

2、及磁小體的合成產(chǎn)生明顯的抑制作用。本研究主要嘗試對AMB-1的抗氧化代謝系統(tǒng)在菌體生長、磁小體合成中的重要作用進行初步探索研究。
　　1.AMB-1的兩個超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)的生物信息學分析
　　對趨磁菌AMB-1的兩個超氧化物歧化酶Fe-SOD及Cu/Zn-SOD從初級結構到空間結構等生物信息學方面進行初步研究。結果表明：fesod基因全長597bp，編碼199個氨基酸，不含有信號肽序列，在1

3、19到137氨基酸間可能存在一個跨膜結構，其蛋白三級預測結構同Thermophilic CyanobacteriumThermosynechococcus Elongatus中的Fe-SOD最為相似；cu/znsod基因全長531bp，編碼177個氨基酸，可能含有信號肽序列，并且在前50個氨基酸序列可能存在2個跨膜結構，其蛋白三級預測結構同Salmonella typhimurium中的Cu/Zn-SOD最為相似。
　　2.AMB

4、-1超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)在大腸桿菌中的克隆表達
　　在本研究中，趨磁菌AMB-1來源的fesod和cu/znsod在大腸桿菌BL21(DE3)中進行克隆表達。通過PCR的方法從AMB-1的基因組中擴增到兩個SOD基因片段，分別連接到IPTG誘導型表達載體pET-20b上，得到重組質粒pET-20b-fesod-histag和pET-20b-cu/znsod-histag，并電轉化E.coil BL21

5、(DE3)。生長曲線表明：重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)以及BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histag)生長速率及生長最終密度明顯高于對照組BL21(DE3)/(pET-20b)。重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histagl)以及BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag，)單位細胞中SOD活力明顯高于對照組BL21

6、(DE3)/pET-20b)。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)：fesod得到了有效表達，蛋白分子量約為22 KDa；在BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)重組菌株的誘導表達中，一個推測為宿主菌中SOD蛋白(分子量約為24 KDa)的表達水平逐漸上升，而cu/znsod沒有得到表達。
　　3.通過基因工程手段提高AMB-1超氧化物歧化酶的表達水平
　　為提高趨磁菌AMB-1對氧的耐受水平，嘗

7、試通過基因工程手段增強該菌內Fe-SOD和Cu/Zn-SOD兩種超氧化物歧化酶的表達水平。利用可以在革蘭氏陰性菌中復制遺傳的廣宿主載體pBBR1-MCS-4，實驗中構建了兩個游離型重組載體pBBR1-P16-fesod-histag和pBBR1-P16-cu/znsod-histag。同時，利用AMB-1基因組中的rDNA作為同源整合的目標序列區(qū)段，實驗中構建了兩個同源重組整合型載體pET-20b-rDNA-P16-fesod-hist

8、ag和pET-20b-rDNA-P16-cu/znsod-histag。在構建的載體中，氨芐青霉素抗性基因(ampr)作為主要的篩選標記，AMB-1中組成型強啟動子P16和來源于pET-20b的T7轉錄終止子構成主要的表達元件。通過電轉化，游離型載體尚未能夠成功轉入AMB-1中，整合型載體也未能整合至基因組的rDNA區(qū)段。
　　4.不同濃度的還原劑對AMB-1菌體生長及磁小體合成的影響
　　為探索AMB-1生長及磁小體合成的