在海馬神經(jīng)元中BDNF通過SRC信號通路上調(diào)MLC2磷酸化水平.pdf

1、一、研究目的及背景
　　肌球蛋白(Myosin)家族屬于馬達蛋白超家族，可以將細胞內(nèi)的機械能轉(zhuǎn)化為化學能，進而參與生物體內(nèi)一系列生理生化反應。目前已發(fā)現(xiàn)超過20種肌球蛋白分子，在結(jié)構(gòu)和功能上具有差異，但都可以通過頭部結(jié)合ATP酶水解ATP沿actin進行移動。目前研究最多是MyosinⅡ，即肌球蛋白Ⅱ。MyosinⅡ最早在肌肉中被發(fā)現(xiàn)，通過水解ATP產(chǎn)生的能量介導肌肉收縮。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在非肌肉組織，如神經(jīng)元中也存在Myos

2、inⅡ的表達，稱為非肌肉型MyosinⅡ(non-muscle myosinⅡ，NMⅡ)。MyosinⅡ是一個六聚體，包含一對高分子量的重鏈(MHC)及結(jié)合在重鏈頸部的兩對小分子量的輕鏈(MLC)，其中包含兩條調(diào)節(jié)型輕鏈和兩條必要型輕鏈。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MyosinⅡ有較高的表達，并起著重要的調(diào)控作用，主要參與神經(jīng)元的遷移、突起的生長及導向、微管在神經(jīng)元生長錐內(nèi)的狀態(tài)與轉(zhuǎn)運、肌動蛋白(actin)的動態(tài)變化、樹突棘spines的形成等過程

3、。NMⅡ的活性主要受其輕鏈MLC2的激活調(diào)控，參與的激酶主要有肌球蛋白輕鏈激酶（Myosin light chain kinase，MLCK）及Rho亞家族(RhoA)激酶。NMⅡ作為細胞內(nèi)基礎的馬達蛋白也參與到腦的高級功能中。文獻報道MyosinⅡ在早期長時程增強(Long Term Potentiation，LTP)的維持過程發(fā)揮作用;并且通過不同信號激活，分別參與到長時程條件性恐懼記憶的整合階段，及緣下回(infralimbic

4、cortex，IL)腦區(qū)味覺厭惡記憶的消退中。目前的報道多以直接干擾重鏈的形成從而影響MyosinⅡ功能為主，但是MyosinⅡ活性上游受到哪些因素調(diào)控，并沒有詳細的報道。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是腦中廣泛存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過與膜上兩種不同親和力的受體-高親和力酪氨酸激酶受體B(Tropomyosin receptor kinase B，Trk)和

5、低親和力神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(The Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor，P75NTR)結(jié)合，激活下游信號通路。BDNF除了能夠促進神經(jīng)元的存活及分化、突起的生長，還在突觸可塑性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。突觸的可塑性也被廣泛認為是學習記憶的分子基礎，調(diào)控神經(jīng)元之間的信息傳遞。在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，BDNF能夠誘導LTP的產(chǎn)生并維持LTP的穩(wěn)定。BDNF還可以通過調(diào)控肌動蛋白(actin)的動態(tài)

6、變化促進樹突棘的形成。BDNF是否對MyosinⅡ的活性存在調(diào)控作用，具體的信號通路又是什么？
　　本文采用分子生物學及細胞生物學的多種方法，證實BDNF/TrkB信號通路可以上調(diào)調(diào)節(jié)型輕鏈MLC2的磷酸化水平，從而上調(diào)MyosinⅡ活性。進一步證明這一過程并不依賴TrkB下游經(jīng)典的三條信號通路，而是通過SRC家族的LYN激酶實現(xiàn)的。本研究可更好的幫助我們了解MyosinⅡ的功能及作用機制。
　　二、實驗方法
　　1、

7、構(gòu)建各種小干擾片段。
　　2、特異性MLCK短肽
　　3、海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染。
　　4、Western Bolt及CO-IP
　　三、實驗結(jié)果
　　1、BDNF通過高親和性受體TrkB調(diào)節(jié)MLC2磷酸化。
　　首先通過蛋白免疫印跡的方法發(fā)現(xiàn)，給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元BDNF刺激30min時，p-MLC2灰度值較con組明顯增加（p＜0.05，而且隨時間增加（2h時）灰度值持續(xù)增加(p≤0.01)

8、。在給予BDNF刺激前加入抑制P75NTR功能的短肽(TAT-Pep5)、Trk激酶抑制劑(K252a)預處理30min，與對照組相比較，K252a+BDNF組p-MLC2灰度值并無明顯增加。同樣的給予老鼠海馬腦區(qū)注射BDNF、K252a結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDNF組p-MLC2明顯增加(p＜0.05)。
　　2、BDNF通過激活MLCK調(diào)控MLC2磷酸化
　　我們發(fā)現(xiàn)分別給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元磷酸酶抑制劑(CalA)、ROCK激酶

9、抑制劑(Y27623)、MLCK激酶抑制劑（ML-7）預處理30min后，BDNF刺激2h，ML-7+BDNF組p-MLC2沒有明顯升高。在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中加入特異性短肽抑制MLCK與MLC2結(jié)合后，BDNF刺激2h，TAT MLCK+BDNF組p-MLC2并無明顯變化。
　　3、SRC通路參與BDNF調(diào)控MLC2磷酸化水平變化
　　之前發(fā)現(xiàn)BDNF對p-MLC2的調(diào)控依賴TrkB的激活，我們分別給予體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)

10、元TrkB下游三條經(jīng)典信號通路抑制劑U0126(MAPK信號通路抑制劑)，U73122（PLCY信號通路抑制劑），LY294002（PI3K信號通路抑制劑）30min預處理后，BDNF刺激2h，與BDNF組相比較，U0126+BDNF、U73122+BDNF、LY294002+BDNF組p-MLC2灰度值無明顯變化(p＞0.05)，這提示我們BDNF對p-MLC2的調(diào)控不是通過三條經(jīng)典信號通路發(fā)揮作用。接下來給予TrkB下游SRC信號通

11、路抑制劑PP130min后，BDNF刺激2h，與BDNF組相比較，PP1+BDNF組p-MLC2灰度值顯著降低(p≤0.05)。分別干擾SRC家族成員，發(fā)現(xiàn)干擾掉LYN激酶后加BDNF刺激時p-MLC2無明顯升高。
　　4、LYN作為上游蛋白調(diào)節(jié)MLCK磷酸化水平
　　我們通過免疫共沉淀的方法，檢測LYN-Myc與MLCK-HA是否存在結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LYN與MLCK存在相互作用。接下來干擾捧LYN的表達，BDNF刺激2h，p