細菌染色技術(shù)

1、細 菌 染 色 技 術(shù),細菌染色方法,細胞不染色而背景染色,燃料與細胞結(jié)合而染色,常用的染色方法,革蘭染色：最經(jīng)典常用；革蘭陽性、陰性菌；初步識別特殊形態(tài)抗酸染色：抗酸性、非抗酸性細菌；用于結(jié)核病、麻風病等熒光染色：敏感性強、效率高、易觀察；用于結(jié)核分枝桿菌等其它：鞭毛染色鞭毛有無、位置、數(shù)量； 異染顆粒染色白喉棒狀桿菌； 莢膜染色,常用燃料,堿性染料 帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結(jié)合。常用的染料有堿

2、性復紅、結(jié)晶紫、亞甲藍等。酸性染料:顯色離子帶負電荷，易與帶正電荷的被染物結(jié)合。 通常用來染細胞質(zhì)，而很少用于細菌的染色。常用的染料有伊紅、剛果紅等。復合染料（中性染料）：是堿性染料和酸性染料的復合物，如瑞氏染料（伊紅亞甲藍）、姬姆薩染料(伊紅天青)等；熒光染料：如熒光標記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。用于某些特殊的染色技術(shù)。脂溶性染料 如Sudan black。,染色方法的分類,1.單染法:采用一種染料染色 如

3、用美蘭或稀釋石炭酸復紅等，使各種細菌均染成同一種單一的顏色。故此法只能顯示細菌的形態(tài)及大小，對細菌的鑒別價值不大。2.復染法（鑒別染色）: 采用兩種或兩種以上的不同染料進行先后染色，使不同種類的細菌、同種細菌的不同結(jié)構(gòu)，分別染上不同的顏色，以便鑒別細菌。,染色過程,,,涂片,干燥,固定,,染色,水洗、吸干,鏡檢,細菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu),基本形態(tài)球菌桿菌弧菌特殊結(jié)構(gòu)芽孢：枯草桿菌、破傷風梭菌莢膜：肺炎鏈球菌鞭毛

4、：變形桿菌,標本處理,痰液：用無菌棉簽挑取干酪樣或膿性痰部分0.05-0.1ml，涂于載物玻片右2/3 處，均勻涂抹成卵圓形痰膜（約2cm長),每張玻片只涂一份標本。 膿液： 同痰涂片法。病灶組織或干酪塊等：先用組織研磨器磨碎后再行涂片。大小、厚度同痰涂片。體液標本：取標本10ml，3000rpm,離心30min，取沉渣涂片。大小、厚度同痰涂片。腦脊液：將腦脊液離心或甩片集菌后涂片備用。大便：取粘液便或者血便少量均勻涂布玻片，

5、不可過厚。,標本處理注意事項,標本應以打圈的方式反復涂抹均勻，避免標本涂布不均影響結(jié)果判讀，或使染色不均造成陰陽不定。標本涂布不能過厚，影響染色效果。體液標本應濃縮集菌后取沉渣涂片。,普通染色法,革蘭染色法（Gram Stain）,是最常用的鑒別染色法之一。此染色法是由丹麥細菌學家 Christian Gram氏于1882～1884年發(fā)明的，至今已逾百年，仍在廣泛使用，是細菌學中最為經(jīng)典的染色方法。,一、原理 細菌

6、經(jīng)結(jié)晶紫初染染成藍色。G+菌細胞壁肽聚糖層數(shù)多，且肽聚糖為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，染料復合物不易從細胞內(nèi)漏出，仍為藍色。而G-菌細胞壁脂類含量多，肽聚糖層數(shù)少，且肽聚糖為平面片層結(jié)構(gòu)，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，結(jié)合的染料復合物容易泄漏，細菌被脫色為無色，再經(jīng)石炭酸復紅稀釋液復染成紅色。,二、步驟,標本處理,,用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫(crystal violet)。 媒染劑的作用是增加染料

7、和細胞之間的親和力或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落。 不同類型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精(ethanol)。 復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，常用的復染液是番紅。,三、結(jié)果: 陽性菌——紫色 陰性菌——紅色,固定 初染

8、 媒染 脫色 復染 革蘭氏陽性菌，用符號“G+”或“GP”（Gram’s Positive）表示。 革蘭氏陰性菌，用符號“G¯”或“GN”（Gram’s Negative）表示。,,,,,,,,,,,,,,,,,四、影響因素,1.操作：涂片的厚薄，不宜過厚染色時間的把握，尤其是脫色時間，脫色不宜過度固定過程不可用酒精燈直接加熱，避免過熱使菌體變性而影響染色效果。,2.染液 染液用完

9、后應及時蓋上蓋子，以免揮發(fā)影響染色效果3.細菌因素 被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如培養(yǎng)時間過長革蘭陽性菌可能染成陰性，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內(nèi)。 某些細菌存在染色困難、不易脫色等情況，可能會出現(xiàn)染色不均，陰陽不定的現(xiàn)象。,五、臨床意義,鑒別細菌： 用革蘭氏染色法可將所有細菌分為陽性與陰性兩類，可初步識別細菌，以利進一步鑒定。選擇藥物：

10、 可根據(jù)革蘭氏染色性的不同，供臨床初步選擇用藥方向。與致病性相關(guān)： 大多數(shù)革蘭氏陽性菌的致病物質(zhì)為外毒素，而大多數(shù)革蘭氏陰性菌的致病物質(zhì)為內(nèi)毒素。由此，可采取有針對性的治療方案。,革蘭氏陽性葡萄球菌例子 (金黃色葡萄球菌 x 1000),革蘭氏陽性鏈球菌例子,革蘭氏陰性桿菌例子 (大腸桿菌 x 1000),革蘭氏陰性弧菌例子,革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢桿菌例子,革蘭氏陽性短桿菌例子 (李斯特菌 x 1000),革蘭氏陰

11、性彎曲菌例子,革蘭氏陽性棒狀桿菌例子,抗酸染色法,一、原理 結(jié)核菌、麻瘋桿菌、恥垢菌等抗酸性菌，因其菌體表面有一層類脂或脂質(zhì)之皮膜不易著色，但一經(jīng)著色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脫色。利用這特性并以增強的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以處理，使其脫色后再對比染色，此時抗酸性菌仍是固定著最初色素的顏色（紅色），也就易于鑒別。,涂片固定 酸性復紅初染 3%鹽酸酒精脫色

12、 美藍復染 鏡檢,,,,,標本處理,,二、步驟,染色過程中的細菌顏色變化：,,,,,,,,,,,,抗酸桿菌,非抗酸桿菌,三、結(jié)果: 抗酸菌———紅色； 非抗酸菌——藍色。,抗酸染色注意事項,每張玻片只能涂一個標本，以免染色過程中因沖洗使菌體脫落，造成陰陽性結(jié)果混淆；注意生物安全，自我防護；脫色時間依據(jù)涂片厚薄適當調(diào)整，以無紅色為止。,抗酸染色的意義：用以鑒別抗酸菌（如

13、結(jié)核桿菌和麻風桿菌）和非抗酸菌。,熒光染色法,一、原理 抗酸桿菌用熒光燃料Auramine O(金胺O)染色后，用含有紫外光源的熒光顯微鏡檢查，將會發(fā)出閃亮的橘黃色。這種方法可用較低倍鏡頭鏡檢，因此能快速找出抗酸桿菌。,二、步驟：,涂片固定 金胺O染色 鹽酸酒精脫色 復染 鏡檢,,,,,,涂布均勻，不可過厚,時間可稍微延

14、長，但不可少于規(guī)定時間,脫色時間依片子厚薄適當調(diào)整,復染時間不可過長,熒光顯微鏡觀察有無黃綠色熒光,標本處理,,三、結(jié)果: 陽性—明亮橘黃色熒光； 陰性—無熒光,三、臨床應用： 熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。四、注意事項： 熒光染色法可以作為分枝桿菌的初篩實驗，初篩

15、陽性的須做抗酸染色確認。,特殊結(jié)構(gòu)染色法,細菌的某些基本結(jié)構(gòu)如細胞壁、核質(zhì)、胞漿顆粒和特殊結(jié)構(gòu)如莢膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易著色，須用一些特殊染色法才能染上顏色。特殊染色法主要有莢膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、異染顆粒染色法等。這些染色法不僅能使特殊結(jié)構(gòu)著色，還可使特殊結(jié)構(gòu)染成與菌體不同的顏色，有利于觀察和區(qū)別。,負染色法,所謂負染色法是指使背景著色而細菌本身不著色的一種染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如剛果紅或

16、水溶性苯胺黑等進行染色。因酸性染料帶負電荷，而細菌本身在近乎中性的環(huán)境中也帶負電荷，同種電荷相排斥，故染色時菌體不著色，而只能使背景著色。實踐中常用墨汁負染色法配合單染色法（如美蘭染色法）檢查細菌的莢膜，使背景成黑色；菌體呈藍色；而莢膜不著色，從而使莢膜包繞在菌體周圍成為一層透明的空圈。,墨汁染色法,標本：腦脊液處理方法：離心或用細胞離心機離心濃縮染色方法：墨汁染色（負染色）結(jié)果：,在細菌檢驗工作中，除異染顆粒染色法較常用外，由于

17、其它特殊結(jié)構(gòu)染色法操作費時，費用較高、染色過程要求非常嚴格，而普通染色法雖不能使特殊結(jié)構(gòu)本身著色，但菌體著色后，莢膜和芽孢部分由于不著色也能顯示出來，再加上特殊染色法比較復雜，故日常工作中較少使用這些特殊結(jié)構(gòu)染色法。,特殊染色,鞭毛染色,質(zhì)量控制,每批或每天染色時應同步進行質(zhì)控，質(zhì)控方法如下：,,被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的,陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在

18、,18~24h,之內(nèi)。,,被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的,陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在,18~24h,之內(nèi)。,常見細菌圖例,肺炎鏈球菌,無乳鏈球菌,化膿鏈球菌,缺陷乏養(yǎng)菌,腦膜炎奈瑟氏菌,淋病奈瑟菌,產(chǎn)單核李斯特菌,紅斑丹毒絲菌,奴卡氏菌,豚鼠/嗜水氣單胞,類鼻疽單胞菌,巴斯德菌屬,陰道加特納菌,軍團菌,產(chǎn)氣莢膜梭菌,巴斯德菌,霍亂弧菌,新型隱球菌,布魯氏