常規(guī)石蠟制片he染色技術

1、光鏡下觀察組織標本需克服的幾個問題,如何保持組織標本取材前的形態(tài)？ 如何制備薄組織片，允許光的通過而便于 觀察？ 如何使不同組織結構具有不同的光折射 率，便于對標本進行結構的仔細辨別？,光鏡標本的基本制作技術,第二章,光鏡樣本的基本制作技術（組織制片技術）是醫(yī)學研究和生物學研究中，觀察細胞、組織的正常或病理形態(tài)變化的一種必不可少的手段，借此可以彌補活體觀察的不足 同時光鏡樣本的基本制作技術

2、也是其它光鏡標本技術的基礎,取材 固定 漂洗 脫水 透明 浸蠟 包埋 切片 脫蠟 染色 脫水 透明 封片,,,,,,,,,,,,,光鏡樣本的制作的基本過程,第一節(jié) 取材及固定,醫(yī)學研究的組織樣本來源 人體（最好

3、） 臨床的活檢組織 尸檢組織 （取材方法及注意事項按病理學要求進行） 正常組織 用正常動物的組織材料替代,一、動物致死法,動物的福利，3R原則 動物致死法選擇 致死動作應迅速,1．斷頭法 2．擊頭法 3．麻醉法4．股動脈放血法 5．空氣栓塞法,動物致死方法,細胞標本制備,1. 印

4、片法 2. 穿刺法 3. 沉淀法 4. 培養(yǎng)細胞標本制備,二、取材及注意事項,1．材料保持新鮮2．組織塊免受擠壓3．組織塊力求小而薄 4．盡量保持組織的原有形態(tài)5．選取好組織塊的切面 6．動物品種的選擇和熟悉取材的解剖位置7．切除不需要的部分8．保持材料的清潔,三、組織固定法,固定是使要觀察的組織構造盡量接近它取材前的狀態(tài),（一）固定目的 1．標本不發(fā)生離開身體后或死后變化

5、 2．隨后處理中，標本不易損壞 3. 組織塊硬化 4．使組織內(nèi)各種結構產(chǎn)生不同的折光 率，或?qū)θ玖暇哂胁煌挠H和力,（二）固定方法 1．蒸氣固定法（較細小而薄的標本） 2．小塊組織固定法（直接投入固定液中） 3．注射、灌注固定法（體積過大或固定 液極難滲入內(nèi)部

6、的組織標本） （1）局部灌注固定（肺、肝、腎、腦等） （2）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、 狗、猴、人） 4. 微波固定法,灌注過程 充分暴露心臟 針尖插入左心室或升主動脈中 快速灌注生理鹽水 剪開右心耳（或右心房）放血

7、 換灌固定液，先快后慢輸入,用量 1. 生理鹽水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、 貓200-250ml、猴300-500ml、 狗800-1000ml 2. 固定液 動物血液量的2倍

8、 動物體重（g）×7%×20（ml）,無論是局部灌注固定，還是全身灌注固定，在灌注完畢后，必須立即將組織塊、器官或整個動物再放入同樣的固定液中進行后固定,1．組織塊不宜過大 2．軟組織或較大塊組織可先經(jīng)2~3小時固定后，再修整成小塊重投入新配制的固定液內(nèi)繼續(xù)固定 3．固定液的量是組織塊大小的5-20倍為宜，在固定組織的瓶底墊上脫脂棉、數(shù)層紗布或濾紙 4．固定時

9、間的長短視固定劑的種類、溫度、組織塊的大小而定,（三）固定注意事項及影響因素,1．甲醛（福爾馬林）：商品甲醛的濃度是37% ~ 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液濃度是10%，而實際甲醛濃度只有4% 固定小塊組織(15×15×2mm)10小時左右 經(jīng)它長期固定的組織，需經(jīng)24~48小時的自來水流水沖洗,四、固定液 （一）單純固定液,甲醛單純固定液的常用配方

10、10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 自來水或蒸餾水 90ml 10%甲醛生理鹽水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 氯化鈉 0. 85g

11、 自來水或蒸餾水 90ml,2．多聚甲醛：一種滲透速度極快的甲醛聚合物，在熱水中可解聚成甲醛單體而溶解，在接近水的沸點時溶解極快；也可溶解于弱堿中。多聚甲醛溶液實際上是新配制的甲醛液，宜臨用前配制,4%多聚甲醛單純固定液的常用配方 多聚甲醛 4g

12、 蒸餾水（或0.2 mol/L PB） 50ml 在通風櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻 0.2 mol/L PB（或蒸餾水） ～100ml,3．戊二醛：一種常用的醛類固定劑，能較好的保存組織結構，但其穿透力弱，作為單純固定液多用于電鏡技術中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用時需配制成1%~6%的不同濃度,4．酒精：單純固定液為80%~95%的

13、濃度，不必水洗而直接脫水。多用于組織化學中的糖原固定 酒精固定的組織易變硬和發(fā)脆、組織收縮較大，所以不易長時間停留其中（70%酒精除外） 可作為配制混合固定液的基本成分,5 ．其它固定液 丙酮 苦味酸 醋酸 重鉻酸鉀 三氯醋酸 鉻酸

14、 氯化汞 鋨酸,用多種具有固定作用的試劑混合配制的固定液，達到各試劑在固定作用中具有的優(yōu)缺點平衡目的,（二）混合固定液,常用混合固定液,1．酒精-甲醛液（A-F 液） 95%或無水酒精（A） 90ml 37%~40%甲醛液（F） 10ml 2

15、．Carnoy液 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml 無水酒精

16、 60ml3．Bouin 液 飽和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（37%~40%） 25ml 冰醋酸 5ml,4．Helly 液

17、 重鉻酸鉀 2.5g 升汞 5g 蒸餾水 100ml （以上是Helly儲存液）

18、 甲醛液(37%~40%) (臨用時加入) 5ml 5．1%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液 多聚甲醛 1g 蒸餾水 50ml 在通風櫥內(nèi)加熱使之完全溶解，然后冷卻

19、 25%戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4） ～100ml,第二節(jié) 固定后處理及切片,一、組織修整 固定結束后，將受擠壓或不需要的部分組織修切或整形，同時選擇好包埋面，稱組織修整。修整可在沖洗前、也可放在沖洗后,二、組織洗滌,洗去滲入組織內(nèi)的固定液，再進行

20、下一步驟的操作；否則會妨礙染色效果，或引起沉淀、結晶而影響觀察，也可能會繼續(xù)發(fā)生化學反應造成后道操作困難 1．水洗滌法：凡用水配制、或含鉻、鋨等的固定液所固定的組織塊，需用水洗滌 2．酒精洗滌法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的組織塊，多采用酒精洗滌,三、組織脫水,（一）脫水意義與脫水劑 因水和石蠟不能相溶，而組織經(jīng)固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蠟進行包埋。需用某

21、些溶劑逐步置換組織塊中的水分，稱脫水 脫水劑必須具有下列特性：1）脫水劑能與水按任意比例混合；2）脫水劑高濃度時不含水分；3）脫水劑也能與透明劑按任意比例互相混合,脫水劑中最常用的是酒精。 一般從70%酒精開始脫水，逐步升高酒精濃度；脫水時間根據(jù)組織塊的種類、大小、及使用的固定液種類等因素而定,70%酒精 2~5小時(可長期保存組織) 80%酒精

22、 2~5小時 90%酒精 2~5小時 95%酒精（Ⅰ） 2~5小時 95%酒精（Ⅱ） 2~5小時 無水酒精（Ⅰ） 30分鐘 無水酒精（Ⅱ） 30分鐘 無水酒精（Ⅲ） 30分鐘,（二）脫水步驟和時間 以18mm×18mm，厚約2~3m

23、m的組織塊 為例，其脫水步驟和參考時間如下,（三）脫水注意事項 1．組織脫水必須掌握由低濃度逐步 過渡到高濃度的原則 2．脫水時間要適度 3．組織脫水要徹底干凈,四、透明,（一）透明意義及透明劑 組織脫水后，內(nèi)部僅含脫水劑，但大多數(shù)脫水劑不能與石蠟相溶，石蠟仍不能浸入組織內(nèi)進行包埋和切片。為此，需要一種既能溶于脫水劑又能溶于包埋劑

24、（石蠟）的溶劑，以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。這一過程往往使組織呈半透明狀，故稱透明 二甲苯為石蠟包埋法中最常用的透明劑；它透明能力強，但易使組織收縮、變脆，故組織塊的透明時間不宜太長，小組織塊以30分鐘為宜，較大組織塊適當延長但不超過2小時,（二）透明步驟和時間 為了減少組織塊過度收縮，往往在無水酒精之后，先經(jīng)過酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入純二甲苯中 透明步驟和時間大致如下

25、 1．無水酒精:二甲苯=1:1 20~30分鐘 2．二甲苯（Ⅰ） 20~30分鐘 3．二甲苯（Ⅱ） 20~30分鐘,（三）透明注意事項 二甲苯必須保持無水 組織塊脫水過程要徹底,五、浸蠟,（一）浸蠟目的 浸蠟是將透明過的組織塊在熔化

26、的石蠟中浸漬的過程。目的是用石蠟代替組織塊中的二甲苯，在隨后溫度下降中，使較軟的組織塊變成有一定硬度的組織蠟塊，以便切片機切片,第1杯熔蠟(軟蠟)(熔點54℃以下) 1小時 第2杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃) 1小時 第3杯熔蠟(硬蠟)(58~60℃) 30分鐘 整個浸蠟時間控制在3小時之內(nèi) 浸

27、蠟在恒溫箱中進行，且恒溫箱溫度高 于石蠟熔點 2~3℃,（二）浸蠟的步驟,（三）浸蠟注意事項 1．浸蠟最佳溫度應是石蠟剛熔化、或蠟杯底部 尚殘留小部分未熔完蠟時的溫度 2．浸蠟中一般采用浸蠟籃浸蠟法，把組織塊和 標簽一齊裝入分格籃內(nèi)浸蠟 3．石蠟應在加熱的條件下過濾除去雜質(zhì) 4．浸蠟用的石蠟要定期更換

28、 5．新石蠟應在使用前放在溫箱內(nèi)熔化一次，使 其中的揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā) 6．包埋結束后應將熔蠟從溫箱內(nèi)取出，以免 石蠟無益地加溫熔化,六、包埋（石蠟包埋法）,（一）包埋目的及包埋劑 包埋是將某些特殊的支持物質(zhì)浸入到組織塊內(nèi)部，利用支持物質(zhì)的物理特性，將整個組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的較硬固態(tài)結構，以便切片機制備極薄切片

29、石蠟是組織學切片技術中最常用的包埋劑,（二）包埋過程 1．取預熱包埋框及金屬板，搭成包埋模具 2. 迅速傾注少量熔蠟于包埋框中 3. 從蠟杯中夾取組織塊，切面向下置于框底 4. 加熔蠟至包埋框上緣 ，將標簽紙緊貼旁邊 5. 表面熔蠟凝結至一定厚度時，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固

30、 6. 凝結蠟塊自動漂浮于水面，或30分鐘后推開 包埋框，取出蠟塊。 7. 修塊,（三）包埋注意事項 1．包埋蠟的熔點選擇 2．石蠟脆性大時，可加蜂蠟提高韌性 3．包埋用石蠟和最后浸蠟的石蠟熔點要 相同 4．包埋中組織塊間要有一定距離 5

31、．石蠟凝固要快速,七、切片,（一）石蠟切片機及切片刀 1．石蠟切片機 最常用的石蠟切片機是輪轉式切片機，它的切片刀固定不動，而靠右側旋轉的重輪帶動螺紋軸和齒輪，將組織塊夾具按所調(diào)節(jié)的切片厚度向前推進，并在上下平面運動，讓組織塊經(jīng)過前下方切片刀而切成一定厚度的切片,2．切片刀與磨刀 石蠟切片常用的切片刀為平楔型切片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以

32、保持其鋒利；研磨刀可分為手工研磨刀和機械研磨刀（磨刀機）兩種,（二）石蠟切片過程 1．修塊 2．蠟塊和切片刀固定 3．調(diào)整蠟塊切面和切片刀角度(10°以內(nèi)) 4. 調(diào)整刀臺與標本臺距離 5. 修整蠟塊切面，暴露完整組織切面 6. 調(diào)整切片厚度調(diào)節(jié)器(厚度為6~8μm) 7. 正式切片

33、8．切片展平 9．貼片和烘片,（1）切片碎卷狀：脫水、透明或浸蠟時間長、浸蠟溫度高 （2）蠟片卷曲：刀口不鋒利或臟、刀角傾斜過度、石蠟過硬 （3）切片不成蠟帶：室溫低、石蠟過硬、蠟塊上下邊過小或 不平 （4）蠟帶彎曲：蠟塊的兩側大小不等、刀口不鋒利 （5）切片皺褶：石蠟過軟、浸蠟不完全、刀的傾斜角度過小 （6）切片厚薄不均：刀口不鋒利、切片機性能不佳、刀架或

34、 刀或蠟塊未固定牢 （7）切片出現(xiàn)縱紋：刀刃有缺口、石蠟或組織的硬度不一 （8）切片出現(xiàn)橫紋：蠟塊、刀或刀架未固定好 （9）切片粘刀：刀鋒沾污、刀的傾斜角度過小、刀口不鋒利 （10）蠟塊底邊呈白色：刀的傾斜角度過小 （11）切片粘蠟塊：刀純、刀口不潔、室內(nèi)溫度高、太干燥,（三）切片過程中常遇問題及可能造成原因,第三節(jié) 蘇木素-伊紅染色方法,染色是將組織浸入染料配制的染色液中，使組織中的不同結構染上不同顏色或

35、不同深淺的顏色，從而產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下清楚地顯示組織內(nèi)部各種構造,染料是一類有色的以苯環(huán)為基礎的有機化合物，它不同于一般顏料，因為它不但有顏色，更重要的是它對組織的不同成份具有不同的親和力。構成染料至少必須有兩種原子團連接于苯環(huán)上，即能使染料顯色的原子團-發(fā)色團和能使染料對不同組織具有不同親和力及加深顏色的原子團（酸、堿性基團）-助色團,分類 細胞核染料有天然染料蘇木素、胭脂紅及人工合成的染料結晶紫、

36、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、焦油紫等 細胞質(zhì)染料有人工合成的伊紅Y、酸性復紅、苦味酸、水溶性苯胺藍等,媒染劑為有些二價或三價金屬物質(zhì)，如鋁、鐵、銅、鎢等可作為中介媒體物質(zhì)，使原來幾乎不與組織結合或結合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）著色；它主要是通過增加染料對組織中某一成份的親和能力，自身又與染料或組織發(fā)生結合而發(fā)揮作用,助染劑（促染劑）與媒染劑不同，它只加強染 料的染色能力，而自身不

37、參與染色反應 分化劑（脫色劑、分色劑）用于退行性染色 法中脫去組織過染的染料，降低著色顏色 酸性分化劑 0.5~1%的鹽酸酒精（95%以 下）或較稀的冰醋酸水溶液 氧化分化劑 苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、 過錳酸鉀等

38、 媒染分化劑 既能促使組織和染料結合， 又可使已經(jīng)結合到組織上的染料脫離,一、蘇木素-伊紅染色的基本原理,蘇木素和伊紅染色是組織學中常規(guī)制片中最基本，也是應用最廣泛的染色方法，故稱常規(guī)染色（簡稱HE染色）,蘇木素（或蘇木精）是一種天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是較好的細胞核堿性染料，并可將細胞中不同的結構分化出各種不同的顏色；蘇木素分子須經(jīng)氧化形成蘇木紅分子，才具有真正的染色能力；同

39、時須配合適當?shù)拿饺緞┮栽鰪娝鼘M織的親和力，達到染色目的 伊紅（或曙紅）是人工合成的煤焦油類染料，紅色粉末狀，易溶于水或酒精，為酸性細胞胞質(zhì)染料；有伊紅Y、B、BN等，常用的是伊紅Y。伊紅常作為蘇木素的對比染色染料，染色中常需加助染劑和分化劑，使染色效果更加好,二、蘇木素-伊紅染液的配制,（一）蘇木素染液 一種是將氧化劑（如氧化汞、高錳酸鉀、過氧化氫或碘酸鈉等）與媒染劑（硫酸鋁銨、硫酸鋁鉀或硫酸鋁鐵等）直

40、接混合于蘇木素中配成溶液 另一種是先用媒染劑媒染組織結構，再用氧化的蘇木素（自然氧化）染色，最后用媒染劑分色,Harris蘇木素染液 蘇木素 1g 無水酒精 10ml 硫酸鋁鉀（或硫酸鋁銨） 20g 蒸餾

41、水 200ml 氧化汞 0.5g,Mayer蘇木素液 蘇木素 1g 蒸餾水 1000ml

42、 碘酸鈉 0.2g 硫酸鋁鉀 50g 枸櫞酸鈉 1g 水合氯醛 50g,醇溶性伊紅染液

43、 伊紅Y 0.5g 95%酒精 100ml 水溶性伊紅染液 伊紅Y 0.5-1g 蒸餾水

44、 75ml 95%酒精 25ml 冰醋酸 1~2滴,（二）伊紅染液,（三）分化液,去除過度染色或不需要著色的組織成份上顏色的過程，叫分色　　　所使用的試劑配制的液體稱為分化液　　　而蘇木素的分化過程中，使酸性條件轉變成堿性

45、條件，蘇木素染色的結構也由紅色轉變成藍色，所以這一過程又稱藍化,1．氫氧化銨水溶液（pH 7.5-8.0 ） 氫氧化銨（氨水） 3ml 蒸餾水 1000ml 2．1%鹽酸酒精溶液 鹽酸

46、 1ml 70%酒精 99ml,三、石蠟切片染色中脫蠟、水洗、 脫水和透明等的作用,石蠟 去石蠟 去二甲苯 水化 顏色 二甲苯 酒精 水 染液 透明 脫水

47、 水分 二甲苯 酒精,,,,,,,,四、染色程序,（一）脫蠟至水 石蠟切片 冰凍切片 1．二甲苯（Ⅰ） 5分鐘 2．二甲苯（Ⅱ） 5分鐘 3．

48、無水酒精（Ⅰ） 5分鐘 4．無水酒精（Ⅱ） 5分鐘 5．95%酒精 5分鐘 6．80%酒精 1分鐘 7．70%酒精

49、 1分鐘 8．自來水 2分鐘 3分鐘 9．蒸餾水 1分鐘 1分鐘,（二）染色

50、 石蠟切片 冰凍切片 1．蘇木素液 5-15分鐘 1-2分鐘 2．自來水洗 1分鐘 30秒 3．酸性分化液（鏡下控制） 30秒 20秒

51、 4．自來水藍化 20分鐘 20秒 5．稀氨水 30秒 6. 蒸餾水 10秒

52、 20秒 7．70%酒精 3分鐘 3分鐘 8．80%酒精 3分鐘 3分鐘 9．沉淀酸化伊紅乙醇液 30秒 30秒,（三）脫水、透明和封片

53、 石蠟切片 冰凍切片 1．95%酒精（Ⅰ） 1分鐘 1分鐘 2．95%酒精（Ⅱ） 1分鐘 1分鐘 3．無水酒精（Ⅰ）

54、 5分鐘 3分鐘 4．無水酒精（Ⅱ） 5分鐘 3分鐘 5．無水酒精（Ⅲ） 5分鐘 3分鐘 6．無水酒精+二甲苯（1:1） 5分鐘 3分鐘 7．二甲苯（Ⅰ）

55、 5分鐘 3分鐘 8．二甲苯（Ⅱ） 5分鐘 3分鐘 9．二甲苯（Ⅲ） 5分鐘 3分鐘 10．中性樹膠封片,五、染色注意事項,1．染色前需烘烤切片，并立即進行染色 2．切片脫蠟后，應保持切

56、片在液體中，防止干燥。脫蠟溫度應在25℃左右環(huán)境中進行，時間可適當延長 3．獲得好的染色效果，需選擇合適的固定液和固定時間 4．染色時間應根據(jù)染液的種類、新舊、組織種類、固定液種類及環(huán)境溫度等而定 5．蘇木精染色后，分色和藍化應在顯微鏡下進行，以細胞核染色清晰，而胞質(zhì)等基本無色為佳,6．伊紅水溶液染色的切片，易被低濃度酒精脫水時洗掉。最好在脫水至95%酒精時，進行伊紅乙醇液染色，然后脫水透明