武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫構(gòu)建.pdf

1、農(nóng)用抗生素武夷菌素(Wuyiencin)是一種廣譜、高效、低毒的核苷類農(nóng)用抗生素，它對農(nóng)作物的白粉病、番茄葉霉病、番茄灰霉病等真菌病害有良好的防治效果。目前武夷菌素產(chǎn)生菌經(jīng)過誘變、原生質(zhì)體融合等技術(shù)的改造后，其效價(jià)已經(jīng)大幅度的提高，但仍不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求。因此鑒定、分離和克隆武夷菌素產(chǎn)生菌表達(dá)產(chǎn)物和調(diào)控相關(guān)的功能基因，并通過基因改良的方式進(jìn)行武夷菌素產(chǎn)生菌分子定向育種，來提高武夷菌素的效價(jià)及產(chǎn)量變得非常重要。 分離鑒定抗

2、生素合成相關(guān)基因的傳統(tǒng)策略有突變與互補(bǔ)基因分離、表達(dá)文庫免疫篩選分離、基因組文庫篩選及抗性基因連鎖標(biāo)記的分離等，上述幾種克隆抗生素合成基因的策略都需要構(gòu)建大片段基因組文庫，如λ噬菌體文庫、Cosmid文庫、Fosmid文庫、YAC文庫、BAC文庫等。BAC文庫與其他幾種文庫相比具有容量適中、穩(wěn)定性好、嵌合率低、容易分離等特點(diǎn)。成功構(gòu)建BAC文庫是鑒定、分離和克隆武夷菌素合成相關(guān)基因的基礎(chǔ)。 1.本實(shí)驗(yàn)測定了武夷菌素產(chǎn)生菌CK-

3、15菌株的16SrDNA序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析后得出：CK-15菌株與小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)的16SrDNA相似性高達(dá)99.5％，明確武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15菌株為小白鏈霉菌，暫定為小白鏈霉菌武夷變種(Streptomycesalbulusvar.wuyiensis)。 2.以武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15菌株為材料，參照ZhangHB.和MargheritaS.等的BAC文庫構(gòu)建方法，并作了一些改

4、進(jìn)，建立了一套高效的武夷菌素產(chǎn)生菌BAC文庫構(gòu)建技術(shù)體系。體系包括高分子量DNA獲得、部分酶切最佳條件的確定、片段大小選擇的方法、高效的連接轉(zhuǎn)化體系等。 3.利用所建立的高效BAC文庫構(gòu)建技術(shù)體系，以pCC1BAC為載體，構(gòu)建了基因組覆蓋率6.45倍的小白鏈霉菌武夷變種CK-15BAC文庫，這是國內(nèi)外首次構(gòu)建小白鏈霉菌武夷變種進(jìn)行BAC文庫。小白鏈霉菌武夷變種CK-15菌株BAC文庫包含462個(gè)BAC克隆，隨機(jī)挑取20個(gè)白色克