基因合成與細(xì)菌染色方法學(xué)研究.pdf

1、合成生物學(xué)是以工程學(xué)的思想，“從頭合成”并且定向改造生物的基因組，從而達(dá)到創(chuàng)建新生物元件、代謝途徑，以及合成新的生命。人工合成或改造病原微生物的基因組，制備低毒或者無毒的疫苗是合成生物學(xué)的重要內(nèi)容之一。DNA片段體外合成技術(shù)是合成生物學(xué)實(shí)現(xiàn)從頭合成和定向改造的有效手段和途徑。體外DNA片段合成基于2種基本方法:分別為DNA連接酶的片段連接法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，上述方法已經(jīng)被廣泛使用。目前用于實(shí)驗(yàn)的病原微生物有很多，實(shí)驗(yàn)室泄露致命

2、的病原體事件已被廣泛報(bào)道。實(shí)驗(yàn)過程中灑落的病原體培養(yǎng)物、污染物都很容易被人們忽視，為了保證病原微生物實(shí)驗(yàn)操作者的安全，需要一種方法來指示和標(biāo)記病原微生物及其培養(yǎng)物。
　　本研究提出一種高保真DNA單向合成方法（High fidelity DNA unidirectionsynthesis method， HFUS法），主要是利用Phusion DNA聚合酶、BsrDI限制性內(nèi)切酶和Lamda外切酶協(xié)同反應(yīng)，將一條正向寡核苷酸單鏈和

3、數(shù)條反向寡核苷酸單鏈，通過順序擴(kuò)增的方式，最終合成出目標(biāo)DNA片段。其突出的優(yōu)勢在于可以快速合成長度超過150nt的寡核苷酸單鏈，其基本原理是向反應(yīng)體系中投入一條正向寡核苷酸片段seq_F和數(shù)條反向寡核苷酸片段seq_r2-r9，首先是寡核苷酸單鏈seq_f和seq_r1片段互補(bǔ)配對序列彼此接合，在72℃Phusion DNA聚合酶的作用下補(bǔ)齊為雙鏈。接著，50℃BsrDI限制性內(nèi)切酶識(shí)別上一步合成的雙鏈r1末端酶切識(shí)別位點(diǎn)，將其特異性

4、切除，從而暴露出DNA反向鏈上磷酸化的5'端。最后，在37℃Lamda外切酶特異性識(shí)別DNA反向鏈上的磷酸化的單鏈，并從5'端進(jìn)行外切，其結(jié)果將互補(bǔ)鏈DNA片段切去部分或者完全切去，此時(shí)一次循環(huán)結(jié)束。下一次循環(huán)開始，新合成的seq_f-r1片段下游序列與下一個(gè)片段seq_r2的3'端部分序列互補(bǔ)配對并接合后，DNA聚合酶將其延伸，產(chǎn)生seq_f-r1-r2的雙鏈片段，再經(jīng)酶切和外切后，數(shù)次循環(huán)后即可產(chǎn)生DNA目標(biāo)產(chǎn)物。
　　本研究

5、對建立DNA合成方法中寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)及各片段的比例，3種酶的用量及反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了摸索，并成功合成171bp，340bp，480bp3條DNA片段驗(yàn)證了新方法的可行性。本實(shí)驗(yàn)快速合成171bp，340bp，480bp DNA3條DNA片段，探索了一種DNA合成新的方法，為DNA合成方法提供了新的思路。
　　本研究探索了日落黃色素(C16H10N2Na2O7S2)培養(yǎng)細(xì)菌的可行性，制備了日落黃色素培養(yǎng)基并成功培養(yǎng)出大腸桿菌D

6、H5α、志賀桿菌、大腸桿菌O157∶H7，金黃色葡萄球菌等，在實(shí)驗(yàn)中成功將普通微生物和病原微生物做上標(biāo)記。對培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α采用3個(gè)稀釋度(10-5，10-6，10-7)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，來評價(jià)微生物生長狀況。繪制菌體的生長曲線采用OD600波長吸收值分析菌體的濁度，結(jié)果證明日落黃色素對細(xì)菌生長無影響。因此，這種微生物共培養(yǎng)染色標(biāo)記的方法具有廣譜性、高效性、穩(wěn)定性、安全性和直接性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的共培養(yǎng)標(biāo)記方法具有溫和性和新穎性，這種可視