北醫(yī)免疫課程細胞因子和細胞因子受體

1、細胞因子和細胞因子受體Cytokine and Cytokine Receptor,王 露北京大學人類疾病基因研究中心,概述,概念：研究歷史：來源：正常細胞、癌細胞、基因工程,,1957年發(fā)現(xiàn)第一個細胞因子---干擾素，細胞因子以其獨特的生物學活性和潛在的臨床應用價值，一直受到生命領域的高度關注并成為研究熱點。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200余種細胞因子,第一階段：1957-1970，發(fā)現(xiàn)活性，結(jié)構(gòu)不清第二階段：1970-19

2、85，借助分子生物學技術第三階段：1985-2000，發(fā)現(xiàn)細胞因子系統(tǒng)，生物藥開始研發(fā)；第四階段：2003----，發(fā)現(xiàn)更多，更深入，以細胞因子及受體為藥物靶點取得產(chǎn)業(yè)化重大成果。,細胞因子研究歷史,淋巴因子,IFN,IL-2,IL命名IFN克隆成功,LI-1,IL3/4/16命名,細胞因子,19571968197219741975197619791981/2198519861988,TNF

3、,sIL-2R,IL-8,IFNa2a/b上市,199219941995199619972000200220032004200520072012,趨化因子,IL-15/TPO,細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制蛋白CISIL--17,CXCR4/CCR5-HIV,IL-18,IL-19,IL-20/21/22,IL-23/24/25/26/27,IL-28/29/,IL-30/31,IL-32-IL38,

4、細胞因子最新事件,本世紀初，呼吸窘迫綜合征（SARS)、禽流感、甲流等突發(fā)傳染病給人類健康造成嚴重危害，上述疾病的相關病毒使部分感染者病重及死亡的關鍵機理涉及被稱為細胞因子風暴的免疫過程，即：感染引起體液中多種細胞因子大量產(chǎn)生，引起急性呼吸窘迫綜合征甚至多器官衰竭。,,按照結(jié)構(gòu)特征和命名分類,1、白細胞介素(Interleukin, IL)2、集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor, CSF)3、干擾素(I

5、nterferon, IFN)4、腫瘤壞死因子(Tumor-Necrosis Factor, TNF)5、趨化因子(Chemokine, CK)6、生長因子(Growth Factor, GF),,按照功能分類,促炎CK: IL1，TNFα,IL6，IL12，IL17，IL18，IL 23，IL27，IL32，IL33，MIF抗炎CK: IL4，IL10，IL13，TGFβ,IL21，IL25，IL35，IL37，

6、IL1Rα固有免疫CK：TNFα ，IFNα/β,IL1，IL6，IL10，IL12，IL15，IL18，IL23，IL27適應免疫CK：IFNγ，IL2，IL4，IL5，IL10，IL12，IL13，IL17，TGFβ抗病毒： IFNα/β, IFNγ 促T生長： IL2，IL4，IL7，IL9，IL12，IL15，IL21促B生長： IL2，IL4，IL5，IL6，IL7，IL10，IL13，IL14，IL

7、21 造血因子： IL3，IL7，IL9，IL11，GM-CSF,M-CSF,G-CSF,SCF生長因子： VEGF,FGF,TGFα/β,EGF,PDGF,SSF,,1.白細胞介素(Interleukin, IL),1979年第二屆國際淋巴因子專題討論會上命名的，將由白細胞產(chǎn)生的又在白細胞之間發(fā)揮作用的細胞因子統(tǒng)一命名為白細胞介素，正式命名的有IL-1--IL-38。 Interleukin 來自inter-leu

8、kin，意指白細胞之間信使分子，中文譯為白細胞介素。,,白細胞介素的分類,IL-1 家族：IL-1α/β、IL-1Rα、 18 、33IL-2 家族：IL-2、4 、7 、9 、15 、21 (共用γ受體鏈)IL-6 家族IL-6 、11 、27 、30、31 (共用gp130受體鏈)IL-10 家族IL-10 、19 、20 、2

9、2 、24 、26 、28A/B、29 (結(jié)構(gòu)相似)IL-12 家族 IL-12 、23 、 27 、35、37(均為異源二聚體結(jié)構(gòu))IL-17家族：IL-17A、B、C、D、E和F集落刺激因子 IL-3  、 1 、 5 、 6 、 11IL-8（趨化因子）其它IL： IL- 13、14、16 、 32、34,,,

10、IL-21976發(fā)現(xiàn),1979年命名, 1983年從ConA刺激的Jurkat白血病T細胞中克隆成功1979年統(tǒng)一命名為白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）, IL-2含有133aa，分子量為15.5kDaN端有糖基化修飾三個半胱氨酸：58、105、125位IL-2主要產(chǎn)生細胞： 主要由活化CD4+ Th1分泌,CD8+T和NK也能產(chǎn)生T細胞腫瘤細胞系:如人Jurkat和小鼠EL-4T淋巴細胞雜交瘤等

11、IL-2受體：CD25(α)；CDl22(β)；CDl32(γc),IL-2別名BF ( blastogenic factor ); EDF ( eosinophil differentiation factor ); KHF ( killer cell helper factor ); LMF ( lymphocyte mitogenic factor ); LCM factor ( lymphocyte-condit

12、ioned medium factor ) LPF ( lymphocyte proliferation factor ); MAF-C I ( macrophage-activating factor for cytotoxicity I ); PFC-EA ( plaque forming cell enhancing factor ); SCIF ( secondary cytotoxic T-cell inducing

13、 factor ); TCGF ( T-cell growth factor ); TCPA ( T colony-promoting activity ); TDF ( thymocyte differentiation factor ); TMF ( thymocyte mitogenic factor ); TMF ( T-cell maturation factor ); TMF ( T-cell mitog

14、enic factor ); TRF-3 ( T-cell replacing factor-3 ); TSF ( thymocyte stimulating factor ). Costimulator ;,IL-2主要生物學活性,,IL-2對T細胞的作用,,2.集落刺激因子(Colony-Stimulating Factor, CSF),能夠刺激多能造血干細胞和不同發(fā)育階段的造血祖細胞增殖分化，并在半固體培養(yǎng)基中形成

15、相應細胞集落的細胞因子。 根據(jù)刺激不同造血細胞系或不同分化階段的細胞有不同的命名。,,G-CSF(粒細胞集落刺激因子),1983年命名,1986年克隆成功.人G-CSF基因位于17號染色體,人類有兩種不同的G-CSF DNA,分別編碼含207和204個蛋白，有5個半胱氨酸36=42,64=74,17游離。來源多種細胞可產(chǎn)生內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1、IFN-γ活化單核/巨噬細胞可產(chǎn)生，刺激成纖維、內(nèi)皮細胞也可產(chǎn)

16、生，某些腫瘤細胞可產(chǎn)生,,生物學活性：主要作用于中性粒細胞譜系造血細胞的增殖、分化和活化。對人粒細胞、單核細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等有趨化作用。臨床應用： 粒細胞減少癥 腫瘤化療引起血細胞減少癥 貧血和骨髓發(fā)育異常綜合癥,3.干擾素 (Interferon,IFN),具有干擾病毒感染和復制功能的細胞因子。 1957年從病毒感染細胞培養(yǎng)中分離到一種生物活性物質(zhì)，因它可以干擾其它病毒的復制而被命名為干擾素。

17、,,干擾素的命名,根據(jù)來源及對酸的耐受程度，將干擾素分成I 和 II型；I型(IFN-α，IFN-β)耐酸，pH2活性穩(wěn)定，其中白細胞產(chǎn)生的稱白細胞干擾素，成纖維細胞產(chǎn)生的稱成纖維干擾素；II型(IFN-γ)不耐酸，是抗原或有絲分裂原刺激PBMC產(chǎn)生又叫免疫干擾素；后又將其稱為IFN-α，IFN-β，IFN-γ；IFN-α是異質(zhì)性的，包括14個亞型，編碼基因成串排列在9p23，產(chǎn)物高度同源。,,干擾素的產(chǎn)生和作用,,I型

18、干擾素抑制IL-1的產(chǎn)生,,10 –12 g干擾素能在培養(yǎng)組織中保護一百萬個細胞免受一千萬個病毒顆粒的感染,4.腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF),1975年發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)，該因子對多種腫瘤細胞系具有細胞毒作用，而且在多種動物模型中可引起腫瘤壞死，將其命名為腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor， TNF）。 1984TNFα的cDNA克隆成功，后來相繼

19、克隆了該家族的多個成員，構(gòu)成了TNF超家族細胞因子。,,,TNF超家族特征,絕大多數(shù)成員為II型膜蛋白；在特異性金屬蛋白酶作用下，形成可溶形式活性形式多為同源三聚體；TNF超家族包括TNFα，β, TRAIL, FASL等；此外，尚有一批與TNFα序列同源，但缺乏誘導凋亡活性的TNF家族成員。TNF-α:巨噬細胞產(chǎn)生；TNF-β:又稱為淋巴毒素α(lymphotoxin-α，LT-α），主要由活化T細胞產(chǎn)生；TNF-α和T

20、NF-β共用受體，功能相似。,,TNF-α炎性因子：引起發(fā)熱、誘導急性期蛋白合成、介導內(nèi)毒素性休克、誘導細胞凋亡,,,,,,,粘附,5. 趨化因子(Chemokine，CK),趨化運動是指細胞向高濃度刺激物方向的定向運動。,,1999年國際命名委員會根據(jù)CK的結(jié)構(gòu)特征命名依據(jù)N端前兩個半胱氨酸(Cys)的相對位置不同分為:,趨化因子的分類,,CK及CKR生物學功能：,,,抗凋亡,促進凋亡,CK及CKR與T細胞：,6.生長因子(Grow

21、th factor),具有促進不同類型細胞生長效應的細胞因子，如TGF-β、FGF、EGF、VEGF、NGF、PDGF等。,,VEGF-Aisoforms—VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206，VEGF145 ，VEGF183VEGF-B； VEGF-C； VEGF-D。 VEGFR1、VEGFR2 、VEGFR3,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),,細胞因子受體,細胞因子發(fā)揮生物學功能是通過與靶細胞

22、膜表面的受體結(jié)合并將信號傳遞到細胞內(nèi)部。因此，了解細胞因子受體的結(jié)構(gòu)和功能對于深入研究細胞因子的生物學功能是必不可少的。 從細胞因子結(jié)合受體開始，到某些基因轉(zhuǎn)錄的啟動，要經(jīng)歷復雜的細胞內(nèi)分子間的相互作用，這樣的作用過程稱為細胞因子的信號轉(zhuǎn)導；,,1.造血細胞因子受體超家族（I類）,結(jié)構(gòu)特征：是細胞因子受體中最大的一個家族，多數(shù)成員屬于多亞單位受體，其中一種或兩種亞單位多肽負責結(jié)合細胞因子膜外區(qū)序列結(jié)構(gòu)相似于EpoR,即膜外N端含

23、4個高度保守Cys,近膜側(cè)含1個Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser(WSXWS)的基序,,D200,2.IFN受體家族(II類細胞因子受體家族),結(jié)構(gòu)特征：兩條肽鏈組成，胞外區(qū)Fn3樣結(jié)構(gòu)域由200個氨基酸殘基組成，也稱D200，并含有4個不連續(xù)的半胱氨酸，包括IFN和IL-10受體,,3. TNFR超家族,主要包括：TNF、 Fas、 CD40、神經(jīng)生長因子受體等結(jié)構(gòu)特征： 這類受體富含半胱氨酸，在與細胞因子結(jié)合后三聚

24、體化。胞外區(qū)有3-5個由40個氨基酸殘基組成的重復亞單位；每個重復亞單位含有4-6個保守的半胱氨酸；形成“配體結(jié)合區(qū)域。 TNFR I（P55，CD120a）：胞內(nèi)同源序列即“死亡結(jié)構(gòu)域”TNFR II（P75，CD120b）不含死亡結(jié)構(gòu)域,,4. 趨化因子受體（ GPCRs，G-protein coupled receptors ） 屬于7次跨膜受體超家族，胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Gi/Go蛋白偶聯(lián),,CKR分類1、根據(jù)結(jié)合配體

25、的不同，分為CXCR， CCR， XCR, CX3CR；2、根據(jù)特異性不同，分為特異性受體、共享性受體、雜合性受體（DARC：Duffy血型抗原，紅細胞趨化因子受體）、孤兒受體、病毒受體等。,,,,CXCR4和CCR5是HIV感染的共受體,,CXCR4與CCR5是HIV感染靶細胞的共受體,HIV世界第一治愈人　蒂莫西雷-布朗，一名居住在德國柏林的美國翻譯。1995年：血液中攜帶HIV病毒。2006年：白血病。　 化療/干細胞

26、移植。　　主治醫(yī)生迪爾同時思考著艾滋病治愈的可能。 HIV/CD4/CCR5　 　　 迪爾的設想,為了實現(xiàn)這樣的天方夜譚，迪爾醫(yī)生在全世界找到了232名志愿者，他們的骨髓可以與布朗匹配。隨后，對他們進行基因檢測，試圖尋找特定的突變。迪爾醫(yī)生的實驗室將支付這筆40美金/人的檢測費用。　　尋找骨髓源的過程中，上

27、天對布朗表現(xiàn)出更多的是仁慈。第61位捐獻者帶來了福音。找到合適的骨髓源后，他在醫(yī)院中接受了兩次骨髓干細胞移植手術?！　∵@一次，布朗的命運豁然轉(zhuǎn)折，使他成為了千萬分之一的幸運兒?！　∫浦驳母杉毎诓祭鼠w內(nèi)發(fā)揮了應有的作用，源源不斷地產(chǎn)生新細胞，重建起具有CCR5受體缺失的免疫系統(tǒng)。這意味著，HIV病毒在他體內(nèi)漸漸走投無路?！　?010年，布朗體內(nèi)的HIV病毒已被徹底清除，他成為了艾滋病根治的第一人?！　∵@是人類戰(zhàn)勝艾滋病的首個案例

28、，打破了“艾滋病不可治愈”的神話。盡管這項成功難以復制，它仍為艾滋病研究帶來了希望和信心?！　〔祭室惨虼顺蔀榱酸t(yī)學界的明星人物。,,,（二）細胞因子受體的幾個特點1.細胞因子受體共用鏈 兩個或更多細胞因子受體亞單位組成異聚或多聚體形式，包括特異性配體結(jié)合鏈和一個參與信號轉(zhuǎn)導鏈。,,IL-2受體,,IL-2受體家族,gp130參與造血因子受體家族高親和力受體形成和信號轉(zhuǎn)導，不直接參與配體結(jié)合,細胞因子受體共用鏈的意義,節(jié)約；

29、細胞因子功能替代；共用鏈缺失或功能缺陷，將引起嚴重后果，如IL-2R亞家族的 g 鏈缺陷，將引起SCID。,,gC突變導致T細胞發(fā)育障礙,2.可溶性細胞因子受體(sCKR),產(chǎn)生方式：大部分為膜受體脫落，如SIL-1R、SIL -2R、sTNFR、sIFNrR、sGM-CSFR、sIL-5R、sIL-6R等小部分為分泌型，如sIL-4R、sG-CSFR、sIL-5R、sIL-6R生物學活性：膜受體正常代謝途徑

30、膜受體相應配體“競爭抑制劑”,,sCKR與臨床：,檢測：sIL-2R：惡性腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染與其他傳染性疾病、移植排斥反應等sIL-6R：炎癥與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤和白血病等sTNFR： 炎癥與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤和白血病、骨髓移植等治療： 大多數(shù)sCKR與細胞因子結(jié)合后阻斷細胞因子與膜受體結(jié)合，從而抑制細胞因子的生物學活性。應用sCKR為減輕或防止細胞因子造成的病理損害提供了新的治療途

31、經(jīng)。,,細胞因子結(jié)構(gòu)與功能特點,結(jié)構(gòu)：同源性低，小分子蛋白，多為單鏈，少為雙鏈、三聚體（TNF）、多含糖基量微而活性強（pmol/L）,,細胞因子作用特點,旁分泌或自分泌，瞬時、距離范圍小通過與相應受體結(jié)合發(fā)揮作用細胞因子誘導的受體亞單位聚合可以活化蛋白酪氨酸激酶(JAK),導致轉(zhuǎn)錄因子STAT酪氨酸磷酸化而激活靶基因轉(zhuǎn)錄多效性、重疊性、拮抗性、協(xié)同性、網(wǎng)絡性：生理調(diào)節(jié)、病理反應,,59,細胞因子間可相互誘生： IL-1能

32、誘生IFN、IL-1、IL-2、IL-4等， IL-2能誘生TNF、IL-2、LT等。細胞因子可調(diào)節(jié)細胞因子受體的表達： IL-1、IL-5、IL-6等可促進IL-2受體的表達； IL-1能降低TNF受體的密度。 B細胞和T細胞活化過程中，常需要兩種以上細胞 因子的協(xié)同作用或彼此調(diào)節(jié)。,多效性,重疊性（豐裕性）,協(xié)同性,拮抗性,細胞因子的作用具有網(wǎng)絡性,,細胞因子的免疫學功能,調(diào)控免疫細胞

33、的發(fā)育、分化和功能 中樞免疫器官：IL7，SCF,CXCL12 ,IL3，MCSF,MCSF 外周免疫器官：IL4，IL5，IL6，IL13---B細胞 IL2，IL7，IL18-----------T細胞,Treg,Th0,Th17,Th2,Th1,TGFβIL10,TGFβ,IL-10,IFNγ，IL2IL12,IL13,IL4,IL6/IL1TGFβ,IFNγ,IL2

34、,IL4,IL36,IL22,IL17,IL36,IL22,,,,,,,,,細胞免疫,體液免疫,固有免疫,免疫負調(diào)控,調(diào)節(jié)機體的免疫應答,抗感染免疫 抗菌免疫 抗病毒免疫抗腫瘤作用誘導細胞凋亡,細胞因子與疾病,細胞因子風暴（cytokine storm)/高細胞因子血癥,,免疫應答,分泌大量細胞因子,免疫細胞,刺激,,,調(diào)控,,,異常、失控,迅速大量產(chǎn)生細胞因子（TNF,IL1,6，12，8，18等,,異常免疫應答，全身炎癥

35、反應綜合征多器官功能障礙綜合征，ARDS,感染,,細胞因子與炎癥： 炎癥是生命個體其組織與細胞對損傷性因素所產(chǎn)生的防御反應。引起炎癥的因素多種多樣，局部的炎癥發(fā)應有利于機體清除致病因子，嚴重的炎癥可危及生命。炎癥反應是典型的多細胞多因子共同參與的過程。促進和抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展是免疫系統(tǒng)的固有功能，代表機體清除異己，對抗損傷及進行修復的過程。免疫系統(tǒng)參與炎癥的發(fā)生與平息過程主要是通過細胞因子介導的。 抗炎與

36、促炎因子,細胞因子致熱與炎癥病理損傷TNF最為突出,作用多效應，參與天然免疫和適應免疫。IL17：促進多種細胞因子的釋放和招募中性粒細胞，與多種細胞因子協(xié)同放大炎癥反應，具有雙向調(diào)節(jié)作用。IL-1:是促炎反應細胞因子，主要參與抗感染免疫。IL-6：是炎癥網(wǎng)絡的關鍵組分，具有抗炎抑炎雙重作用。IL23:誘導TH17細胞分化，和促進IL17的分泌。也具有雙向調(diào)節(jié)作用。IL-2：維持Treg功能，抑制TH17分化,H5N1病毒感染

37、,固有免疫與禽流感,,腫瘤的發(fā)生與逃逸 骨髓瘤細胞表面高表達IL6R并分泌大量IL6心臟粘液瘤、漿細胞瘤、子宮頸癌及膀胱癌均異常分泌IL6 IL1可刺激急慢性髓樣白血病細胞、漿細胞和卵巢癌細胞生長 多種腫瘤細胞分泌的TGFB、IL-10可抑制機體的免疫功能，有助于腫瘤逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。,免疫系統(tǒng)相關疾病：超敏反應：自身免疫病免疫缺陷病器官移植排斥反應,細胞因子與疾病的治療,細胞因子

38、直接治療細胞因子拮抗治療,已上市的細胞因子重組藥物,,已上市細胞因子抑制劑,細胞因子及受體藥物研發(fā)及應用,IL: IL-2:IL-11；IL-12；IL-1Ra干擾素：IFN-a；IFN-r集落刺激因子：GM-CSF;G-CSF;M-CSF；EPO細胞因子及受體為靶點：FDA批準的單抗有42種，針對細胞因子與受體的有8種,如針對VEGF、EGFR、TNF、IL12/23、IL-6、IL-17a等,,細胞因子的臨床應用舉例

39、,1、重組細胞因子： IFN-α治療肝炎、G-CSF治療白細胞減少、多種細胞因子用于腫瘤病人的細胞治療。2、細胞因子抑制劑：（1）IL-1受體拮抗劑（IL-1ra）治療類風濕關節(jié)炎（2）抗TNF-α抗體治療RA。 TNFa受體和Fc融合蛋白： 依那西普：84.06億美元（2012） 抗TNFa單抗： 英利昔61.39億； 阿達木92.65億； 戈利木6.07億

40、； 塞妥珠6.06億。3.免疫毒素：DAB389-IL-2免疫毒素治療T細胞淋巴瘤,,美國FDA2001年11月批準上市的IL-1ra（Kineret），治療類風濕關節(jié)炎,,治療：炎癥和自身免疫??；T細胞淋巴瘤、白血??；移植排斥等,,,白喉毒素片段（389aa） IL-2,治療T細胞淋巴瘤的細胞因子免疫毒素DAB389-IL2結(jié)構(gòu)示意圖,Bubble-boy (IL-2R的γ鏈

41、缺陷引起SCID),XSCID 基因治療原理,表達細胞因子VEGF的腺病毒或裸DNA直接體內(nèi)注射治療梗塞性血管病,細胞因子檢測常用方法,生物活性檢測法(biossay)--檢測細胞因子的生物學活性免疫學檢測法(immnuossay)--檢測細胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性分子生物學檢測法-檢測細胞因子的mRNA表達芯片檢測：基因、mRNA、蛋白水平,,生物活性檢測法,增殖實驗：應用某一細胞因子能特異刺激或抑制某些指示細胞的增殖,通

42、過[3H]TdR攝入,MTT,反應待測細胞因子的活性水平;集落形成實驗：半固體培養(yǎng)系統(tǒng),造血因子集落刺激因子誘導干細胞形成某一或某些種類的集落.直接殺傷靶細胞：[3H]TdR、51Cr釋放法抗病毒活性：干擾素抑制病毒致病變的程度,計算樣品中IFN的活性單位凋亡實驗：各種試劑盒、流式細胞儀趨化實驗：瓊脂糖中的趨化實驗、微孔小室趨化實驗遷移、侵襲實驗：劃痕試驗、transwell,,免疫學檢測法,放射免疫測定（RIA）

43、：特異Ab包被+待測樣品和同位素標記的細胞因子-竟爭抑制實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）雙抗體加心法Western Blot檢測單個細胞分泌的細胞因子：細胞斑點、酶聯(lián)斑點,,分子生物學檢測,Southern BlotNorthern Blot原位雜交RT-PCR,,體內(nèi)功能研究,基因敲除、轉(zhuǎn)基因利用特異性抗體觀察細胞因子在體內(nèi)的生物學作用,,發(fā)展趨勢和展望,,利用系統(tǒng)生物學破解復雜細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡作用機制；新型細胞因子

44、還會不斷發(fā)現(xiàn)：天然細胞因子發(fā)現(xiàn)（反向生物學）；已知因子改良；重組細胞因子的創(chuàng)制。細胞因子相關藥物開發(fā)細胞因子與疾病的因果關系,一個新的細胞因子CTRP4的發(fā)現(xiàn)與研究,,立題背景,人類基因組計劃大量功能未知的新基因被陸續(xù)克隆并得到鑒定；功能基因組學；以新基因功能探索作為疾病研究和治療切入點；反向生物學策略；新基因高通量平臺篩選；新細胞因子的篩選和鑒定；,,篩選潛在的細胞因子的策略,未知蛋白的生物信息學分析,94,,獲

45、得的基因，ORF克隆連接在真核表達載體,基因篩選平臺,,,功能研究、應用探討,,CTRP4簡介,C1q/TNF related protein4 (homo sapiens) NM_031909.2 Located on11P11 1436bp 2 exons /329 amino acids Predicted molecular weight 35.26KD PI:8.38,

46、,CTRP4簡介,,,CTRP4簡介,,,,真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及表達效果驗證,,,雙熒光素酶報告基因篩選,,,我們得到了一個具有典型信號肽結(jié)構(gòu)，可以活化NF-kappaB炎癥信號通路的新基因。 下一步的工作？,驗證分泌功能研究（體內(nèi)體外）闡明機制,CTRP4 與 NF-kappaB信號通路的調(diào)節(jié),,CTRP4 與 NF-kappaB信號通路的調(diào)節(jié),TNF-alp

47、ha level,EMSA,HepG2 cells,,,CTRP4對下游靶基因影響的篩查,,HepG2 cells,,CTRP4 與IL6/STAT3信號通路的調(diào)節(jié),IL6 Expression：,STAT3 Phosphorylation:,HepG2,,,,,,IL6可被CTRP4劑量依賴性的上調(diào),IL6 Level：,HepG2,,HepG2 Cell lysate,HepG2 Cultural supernatant,,,,N-

48、terminal sequencing,CTRP4的分泌驗證,,,CTRP4的原核表達質(zhì)粒構(gòu)建及原核蛋白純化制備,,,,rhCTRP4對于NF-kappaB信號通路的調(diào)節(jié)活性,HepG2,,,,,rhCTRP4對于IL6/STAT3通路的調(diào)節(jié)作用,HepG2,,rhCTRP4 發(fā)揮功能的動力學特征,劑量依賴性,時間依賴性,IL6,,,劑量依賴性,時間依賴性,TNF-alpha,rhCTRP4對腫瘤細胞增殖能力的影響,HepG2,,,補體

49、C1q分子的結(jié)構(gòu),Trends Immunol. 2004, 25(10): 551-561,17,CTRP4和補體C1q分子之間C1Q球狀結(jié)構(gòu)域的比較,C1Q球狀結(jié)構(gòu)域中完全匹配氨基酸位點主要集中在疏水性氨基酸：丙氨酸（A）、苯丙氨酸（F）、纈氨酸（V）、亮氨酸（L）、甘氨酸（G）等,18,,C1Q球狀結(jié)構(gòu)域的配體譜,,ICs、IgG 、IgM and β- amyloid peptide…,,CRP、SAP and PTX3Fi