豬三種細胞因子免疫增強作用和山羊四種抗血清抑制細胞因子活性分析.pdf

1、細胞因子是由機體免疫細胞和免疫相關細胞分泌的一類高活性多功能蛋白質(zhì)類物質(zhì)，是細胞間的信號傳遞分子，調(diào)節(jié)和介導著體內(nèi)的免疫應答和炎癥反應，是機體免疫學功能發(fā)揮的必要成分。IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ都是機體免疫應答不可缺少的成分，因其具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用而成為免疫佐劑研究的熱點。本研究對豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ進行了誘導表達，進而開展了對口蹄疫合成肽疫苗免疫增強作用的研究，為細胞因子佐劑的臨床應用提供了試驗依據(jù)

2、;又對山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ進行了誘導表達，并進行了各重組蛋白的生物學活性檢測和相應抗血清抑制蛋白活性的研究。
　　1.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ原核表達和生物學活性檢測
　　對含有pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ重組質(zhì)粒的Rosetta2陽性克隆菌進行誘導表達，分別表達了相對分子量為21.4kDa、30.3kDa和20.7kDa的重組蛋白，并對包

3、涵體蛋白進行了純化和復性。通過CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2和IL-4對豬外周血淋巴細胞的增殖活性，并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了重組蛋白IFN-γ的抗病毒活性。結(jié)果顯示豬重組蛋白IL-2能顯著刺激外周血淋巴的增殖，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，在蛋白濃度為10μg/mL時刺激效應最強，但當超過10μg/mL時刺激增殖效應開始減弱;重組蛋白IL-4不能有效刺激淋巴細胞的增殖，增殖效應較弱;重組蛋白IFN-γ能有效抑制VSV在PK15細

4、胞上的復制，具有良好的抗病毒作用，其抗VSV活性為1.135×104U/mg。
　　2.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成膚疫苗的免疫增強作用研究
　　分別將原核表達的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ蛋白以15μg/kg劑量與口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔豬，并設空白對照組(PBS)、口蹄疫疫苗對照組、空載體蛋白對照組，檢測仔豬抗口蹄疫抗體水平和血清細胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的變化

5、，觀察其免疫佐劑效應。結(jié)果表明:制備的IL-2、IL-4和IFN-γ重組蛋白均有較好的生物學活性，其中IL-2和IFN-γ重組蛋白均能顯著提高仔豬抗口蹄疫抗體水平(P＜0.01)，而IL-4重組蛋白抑制口蹄疫抗體的產(chǎn)生(P＜0.01）。血清細胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗+IL-4組的IL-4和IL-10含量均較疫苗對照組顯著升高(P＜0.05），疫苗+IL-2組及疫苗+IFN-γ組的IFN-γ含量較疫苗對照組極顯著升高(P＜0.01)。結(jié)果提

6、示，重組細胞因子IL-2和IFN-γ分別作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗配伍使用，能顯著增強機體的體液和細胞免疫應答。
　　3.山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制重組蛋白活性分析
　　將含pET32a-IL-2、pET32a-IL-4、pET28a-IL-18和pET32a-IFN-γ重組質(zhì)粒的BL21陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導表達，分別表達了相對分子量為35.6kDa、30.7kDa、37.3kDa和22.

7、3kDa的重組蛋白，并對表達的包涵體蛋白進行了純化和復性。利用CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18對山羊外周血淋巴細胞的增殖活性，通過巨噬細胞吞噬功能和硝酸還原酶法檢測了IL-18對鼠腔來源巨噬細胞吞噬中性紅和分泌NO能力的影響，并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了IFN-γ重組蛋白的抗病毒活性，接著進行相應抗血清抑制上述重組蛋白活性的檢測。結(jié)果表明山羊重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18能顯著刺激山羊外周血淋巴細胞的

8、增殖，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，三種重組蛋白分別在5μg/mL、25μg/mL和4μg/mL時刺激效應最強;IL-18對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅和分泌NO能力的影響也與其劑量密切相關，在適宜的濃度范圍內(nèi)隨蛋白劑量增加而能力增強，在IL-18濃度為0.25μg/mL時巨噬細胞吞噬中性紅能力最強，在IL-18濃度為1μg/mL時分泌NO能力最強。山羊重組IFN-γ具有較好的抗病毒作用，其抗VSV活性為2.52×104U/mg?？寡宸忾]試