豬細(xì)胞因子檢測(cè)方法的建立與初應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞因子(Cytokine)是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子的檢測(cè)可以用于多種疾病(感染、炎癥、自身免疫病等)的輔助診斷及疫苗接種后的細(xì)胞免疫功能評(píng)價(jià)，對(duì)于研究病毒感染后病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用機(jī)制也同樣具有重要意義。
　　 細(xì)胞因子是一個(gè)龐大的體內(nèi)功能群體，其檢測(cè)方法很多。根據(jù)檢測(cè)原理和技術(shù)手段，可將細(xì)胞因子的檢測(cè)技術(shù)大致分為免疫學(xué)方法、生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法

2、等三類。目前較為常用的有酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)、熒光定量RT-PCR、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等。
　　 ELISPOT技術(shù)是在溶血空斑技術(shù)和ELISA技術(shù)基礎(chǔ)之上建立起來(lái)的現(xiàn)代免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行單細(xì)胞水平上的精確定量檢測(cè)。目前ELISPOT技術(shù)在全球尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化，研究人員必須采用最佳匹配的包被抗體和檢測(cè)抗體、ELISPOT板、形成斑點(diǎn)的底物及其顯色時(shí)間等，因此在實(shí)際操作中需

3、對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化方能建立較為穩(wěn)定的檢測(cè)體系。
　　 熒光定量PCR技術(shù)是將特異的熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)并做出精確的定量分析，目前該技術(shù)在病原體檢測(cè)等方面已得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)前熒光定量主要包括SYBR GreenⅠ和TaqMan探針?lè)▋煞N。SYBR Green I是一種能夠于雙鏈DNA非特異結(jié)合的熒光染料，適用于所有引物的擴(kuò)增，方法簡(jiǎn)便，成本較低，但熒光染料能夠與dsDNA結(jié)合，因此能與引物二聚體

4、或者非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，需要和熔解曲線分析加以辨別去除影響。而TaqMan探針?lè)ㄊ菍в袩晒鈽?biāo)記探針加入到PCR反應(yīng)體系中，對(duì)引物設(shè)計(jì)要求更高，但同時(shí)檢測(cè)的特異性更高，結(jié)果更為可靠。
　　 近年來(lái)，豬細(xì)胞免疫的研究逐漸引起人們的重視。豬是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。豬群易受多種傳染病侵害，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征(即豬藍(lán)耳病)等都給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。了解病毒與豬免疫系統(tǒng)之間相互作用的機(jī)制，尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制，既

5、有助于防治豬病毒性疾病，也有助于對(duì)新型疫苗誘發(fā)的免疫效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，豬也是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，豬在解剖、組織和生理生化等許多生物學(xué)指標(biāo)上與人類非常相似，被認(rèn)為是研究人類疾病最合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已常被用作異種移植排斥反應(yīng)的模型，因此對(duì)其免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答情況的研究對(duì)于該方面的研究也具有重要意義。
　　 在本研究中，我們著重研究了豬細(xì)胞因子的檢測(cè)方法。我們利用五指山小型豬這一實(shí)驗(yàn)用小型豬，建立了豬細(xì)胞因子的檢測(cè)方法，

6、包括豬IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)方法及豬IL-2、IL-4、IL-10的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法。
　　 在建立豬IFN-γ，的ELISPOT檢測(cè)方法時(shí)，我們選擇了PVDF膜96孔板，然后分別優(yōu)化了捕獲抗體和檢測(cè)抗體的濃度、上板細(xì)胞數(shù)目及刺激物濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)捕獲抗體和檢測(cè)抗體的濃度分別為1:60、上板細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/孔、刺激用病毒量為2×105TCID50時(shí)，獲得了較為穩(wěn)定的檢測(cè)體系。
　　 在建立豬I

7、L-2、IL-4、IL-10的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法時(shí)，我們首先以五指山小型豬cDNA為模板，擴(kuò)增了豬IL-2、IL-4、IL-10的基因保守區(qū)，將其分別克隆入T載體中，構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，將其作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線相關(guān)系數(shù)｜r｜均大于0.990，且擴(kuò)增效率在90％-105％之間。對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法的敏感性較高，IL-4檢測(cè)下

8、限達(dá)到100copies/μL，IL-2、IL-10檢測(cè)下限達(dá)到102copies/μL；重復(fù)性較好，批內(nèi)重復(fù)性與批間重復(fù)性分析變異系數(shù)基本都小于5％。這些評(píng)價(jià)結(jié)果都進(jìn)一步說(shuō)明了我們所建立的定量RT-PCR檢測(cè)方法的可靠性。
　　 在建立豬細(xì)胞因子檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，我們對(duì)其進(jìn)行了初步應(yīng)用。我們采用ELISPOT方法對(duì)PRRSV接種后第0、7、14、21天豬PBMC特異性分泌γ-干擾素情況進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后各豬IFN-γ

9、表達(dá)水平呈明顯上升趨勢(shì)，第21天時(shí)達(dá)到最高峰；未接種的各豬則表現(xiàn)出IFN-γ表達(dá)水平穩(wěn)定無(wú)上升趨勢(shì)。這說(shuō)明豬感染高致病性PRRSV后PBMC分泌IFN-γ能力明顯增強(qiáng)，高致病性PRRSV可誘導(dǎo)豬體內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮抗感染的作用。
　　 同時(shí)，我們還對(duì)攻毒后細(xì)胞中IL-2、IL-4及IL-10 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。用建立的方法檢測(cè)高致病性PRRSV感染仔豬。Taqman熒光定量PCR檢測(cè)各樣品中IL-2、IL-4、IL-1

10、0細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量，同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量，根據(jù)測(cè)得的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中對(duì)應(yīng)的IL-2、IL-4、IL-10基因拷貝數(shù)，以β-actin作內(nèi)參，分析各細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，攻毒后某些豬的各細(xì)胞因子水平變化較大，而對(duì)照組相對(duì)變化較小。下一步還需增加樣本數(shù)才可從中總結(jié)中變化規(guī)律。
　　 本研究將有助于病毒感染后豬體內(nèi)免疫應(yīng)答的研究，對(duì)于豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的比較醫(yī)學(xué)研