赤擬谷盜細(xì)胞色素P450基因的克隆、序列分析及表達(dá)研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450單加氧酶系(cytochrome P450 monooxygenases，P450s)為廣泛分布于生物有機(jī)體內(nèi)的重要酶系。細(xì)胞色素P450是P450s的末端氧化酶，在整個(gè)P450s中起著末端氧化酶(terminal oxidase)的作用，決定著P450s底物的廣泛性和專一性。細(xì)胞色素P450參與許多重要的生命過(guò)程，對(duì)動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌等的研究表明許多不同催化反應(yīng)都?xì)w功于細(xì)胞色素P450的作用。對(duì)于昆蟲而言，細(xì)胞色素

2、P450在昆蟲的生命活動(dòng)中起著十分重要的作用：如固醇類物質(zhì)、保幼激素(JH)、昆蟲信息素、脂肪酸及其相關(guān)化合物、防御物質(zhì)和外源化合物的代謝等，甚至可以合成昆蟲體內(nèi)的長(zhǎng)鏈烴類，具有重要的生物學(xué)和遺傳學(xué)意義。目前已鑒定出200多個(gè)昆蟲細(xì)胞色素P450基因全長(zhǎng)或片段，分屬于CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP15，CYP18，CYP28，CYP48，CYP305等基因家族。 赤擬谷盜Tribolium castaneum(

3、Herbst)是具有重要經(jīng)濟(jì)意義的世界性儲(chǔ)糧害蟲，在世界范圍內(nèi)分布廣泛，我國(guó)絕大多數(shù)省(區(qū))市均有分布，為害嚴(yán)重。此外，赤擬谷盜還是一種重要的模式昆蟲，是第一個(gè)完成了基因組測(cè)序的鞘翅目昆蟲。因此，從基因組水平對(duì)赤擬谷盜P450基因進(jìn)行研究，不僅能為赤擬谷盜的防治提供理論依據(jù)，對(duì)于認(rèn)識(shí)P450的生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特性也有重要意義。據(jù)此，本學(xué)位論文在國(guó)家自然科學(xué)基金(30871631)的資助下，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)赤擬谷盜P45

4、0基因進(jìn)行研究，獲得的主要結(jié)果如下： 1．P450基因的克隆及序列分析 采用RT—PCR方法克隆獲得了1個(gè)P450新基因CYP6BK17的全長(zhǎng)序列。CYP6BK17全長(zhǎng)1816bp，GenBank登錄號(hào)為EU266589，包括由34個(gè)核苷酸組成的5’UTR(5’端非編碼區(qū))、由1515個(gè)核苷酸組成的ORF(開(kāi)放閱讀框)和由246個(gè)核苷酸組成的3’UTR(3’端非編碼區(qū))。ORF編碼515個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白含有血紅素結(jié)合基

5、序FxxGxxxCxG及所有細(xì)胞色素P450的特征基序，如位于螺旋K中參與穩(wěn)定核心結(jié)構(gòu)的ExxR完全保守序列；N端含有由22個(gè)疏水氨基酸組成的跨膜錨定區(qū)域。另外，利用該方法還得到了另1個(gè)新基因(F06)的3’段序列，長(zhǎng)614bp，GenBank登錄號(hào)為EU924172，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為414p，編碼138個(gè)氨基酸殘基，3’UTR含有198bp的核苷酸；推導(dǎo)的氨基酸序列中含三個(gè)P450超家族的特征性保守序列：ETLR區(qū)、PERF區(qū)以及血紅素

6、結(jié)合區(qū)域FxxGxxxCxG。 根據(jù)赤擬谷盜基因組序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到了CYP6BQ13基因的等位基因CYP6BQ13v2，兩者相似性為98％，其ORF長(zhǎng)度為1554bp，GenBank登錄號(hào)為FJ209361。ORF編碼518個(gè)氨基酸，其中N端含有由17個(gè)疏水氨基酸組成的跨膜錨定區(qū)域；推定的氨基酸序列包含所有昆蟲P450基因的5個(gè)特征序列，如血紅素結(jié)合基序FxxGxxxCxG、ETLR區(qū)等。 2．生物信息學(xué)分析

7、 CYP6BK17基因編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量為58.77kDa，理論等電點(diǎn)為9.26，在該數(shù)據(jù)庫(kù)SWISS—MODEL中搜索發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的是人類肝臟的CYP3A4(32％)，以CYP3A4蛋白質(zhì)昌體結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行同源模建，得到了CYP6BK17的三維結(jié)構(gòu)模型，找到了赤擬谷盜的酶解活性中心半胱氨酸Cys442。 CYP6BQ13v2基因推定的氨基酸序列預(yù)測(cè)分子量為59.92KDa，理論等電點(diǎn)為7.60．用Sim4程序?qū)?/p>

8、CYP6BQ13v2基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該基因含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，外顯子/內(nèi)含子邊界符合GT—AG規(guī)則；通過(guò)基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST發(fā)現(xiàn)CYP6BQ13v2基因的cDNA序列只與一個(gè)contig(CtgAAJJ01000808，第2染色體)具有較高的相似性，表明該基因?yàn)閱慰寺』颉?3．系統(tǒng)發(fā)育分析 從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集來(lái)自10個(gè)物種的19條細(xì)胞色素P450基因序列，其中有5條來(lái)自哺

9、乳動(dòng)物，其余均來(lái)自昆蟲。利用MEGA3.0構(gòu)建CYP6BK17的分子進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明CYP6BK17與來(lái)源于赤擬谷盜的CYP6BK10和CYP6BK1的同緣關(guān)系最近，其次是來(lái)源于家蠅(Musca domestica)的CYP6A1和CYP6C1，以及來(lái)源于尖音庫(kù)蚊(Culex pipienspipiens)的CYP6E1。 從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集來(lái)自12個(gè)物種的22條細(xì)胞色素P450基因序列，利用MEGA3.0

10、構(gòu)建CYP6BQ13v2的分子進(jìn)化樹。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CYP6BQ13v2與代謝蛻皮激素、來(lái)源于家蠶(Bombyx mori)的CYP302A1和來(lái)源于果蠅(Drosophila melanogaster)的CYP307A1的同緣關(guān)系較近。 4．基因表達(dá)研究 將CYP6BK17克隆到表達(dá)載體pDest-17的多克隆位點(diǎn)區(qū)，然后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌中，成功建立了CYP6BK17基因的原核表達(dá)系統(tǒng)。