赤擬谷盜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Elp3基因的克隆及RNA干擾研究.pdf

1、CLONINGANDRNAINTERFERENCEOFHISTONEACETYLTRANSFERASEGENE，ELP3，INTRIBoLIUMCASTANEUMBYGaoJingKunADISSERTATIoNSUBMITTEDINPARTALFULFILMENTOFTHEREQUIREMENTSFORTHEDEGREEOFMASTERINPLANTPRoTECTIoNADVISOR：PROFESSOR(PHD)WangJianJun

2、Yf氣NGZHoUUNIVESITYYANGZHOU，JIANGSU，CHINANovember2015赤擬谷盜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Elp3基因的克隆及RNA干擾研究摘要由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases，HDACs)共同調(diào)節(jié)的組蛋白乙酰化是表觀遺傳調(diào)控的一種重要機(jī)制。作為RNA聚合酶II(RNAPII)tg申復(fù)合體的催化亞基，Elp3屬

3、于GNAT家族組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，能夠在體內(nèi)和體外乙?；M蛋白H3和H4。赤擬谷盜Triboliumcastaneum(鞘翅目擬步甲科)是一種危害嚴(yán)重的世界性農(nóng)業(yè)糧食害蟲(chóng)，也是所有昆蟲(chóng)中系統(tǒng)性RNA干擾最有效的昆蟲(chóng)。本文克隆了赤擬谷盜組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Elp3基因，分析了Elp3基因在赤擬谷盜不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上利用RNA干擾(RNAinterference，I斟Ai)技術(shù)研究了其功能，研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步深入了解組蛋白

4、乙?；诶ハx(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的功能和昆蟲(chóng)對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RTPCR)克隆了赤擬谷盜Elp3基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為TcElp3。TcElp3開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1776bp，編碼591個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為6774kDa，等電點(diǎn)為866。高度保守的GNATtypeHAT結(jié)構(gòu)域(efamaccessionnoPF00583)位于羧基端493539位氨基酸；另一個(gè)保守的RadicalS

5、AM(Sadenosylmethionine)結(jié)構(gòu)域(PfamaccessionnoPF04055)位于氨基端98—346位氨基酸。多重序列比對(duì)表明，TcElp3與同為鞘翅目的中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae同源基因的氨基酸序列一致性最高，為8136％，與意大利蜜蜂Apesmellifera同源基因的氨基酸序列一致性為7648％，與小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、黑腹果蠅Drosophilamela

6、nogaster、豌豆蚜蟲(chóng)Acyrthosiphonpisum和褐飛虱Nilaparvatalugens同源基因的氨基酸序列一致性分別為7559％、7530％、7462％和I7454％。系統(tǒng)發(fā)生分析也表明，TcElp3基因與中歐山松大小蠹同源基因的親緣關(guān)系最近。通過(guò)熒光定量PCR研究了TcElp3基因在赤擬谷盜1日齡和3日齡卵、1天、5天和20天幼蟲(chóng)、1天和5天蛹、1天和7天雌蟲(chóng)、l天和7天雄蟲(chóng)等不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明

7、，TcElp3基因在各個(gè)發(fā)育階段都能表達(dá)，其中3日齡卵的表達(dá)水平最低，在5天幼蟲(chóng)中的表達(dá)水平最高，蛹期和成蟲(chóng)期的表達(dá)水平無(wú)顯著差異。RNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TcElp3基因在晚期幼蟲(chóng)被抑制表達(dá)時(shí)，所有干擾組的赤擬谷盜幼蟲(chóng)都能成功進(jìn)入化蛹階段，但是大部分蟲(chóng)體在蛹期發(fā)育遲緩，并出現(xiàn)翅的畸形，9833％的蟲(chóng)體在蛹期死亡。少數(shù)羽化的成蟲(chóng)出現(xiàn)后翅折疊的異常，并在次日全部死亡。RNAi后第6天，分別對(duì)干擾組、IB組和CK組幼蟲(chóng)進(jìn)行過(guò)氧化氫處理，48小