組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF在炎性疾病中的調(diào)控作用.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素共同參與的腸道非特異性炎性疾病。其中，UC是一種主要累及腸道黏膜層，以彌漫性黏膜炎癥和潰瘍性病變?yōu)樘攸c(diǎn)的慢性腸炎。其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，治療進(jìn)展緩慢且缺乏特異性，發(fā)病率在我國(guó)有逐年上升的趨勢(shì)。我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的患病率為

2、11.6/10萬(wàn)，并且已成為消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病和慢性腹瀉的主要原因，且患者多為青壯年，因此日益受到重視。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfatesodium，DSS)是一種硫酸多糖體，能誘發(fā)UC。其機(jī)制可能與免疫細(xì)胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)有關(guān)。
　　目前已有研究表明，IBD不僅與遺傳因素有關(guān)，還與DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控有關(guān)，這些均可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的基因的功能。
　　多發(fā)性硬化(Multiple sclero

3、sis，MS)，是一種中樞神經(jīng)脫髓鞘自身免疫病。多發(fā)生在青年人群中的。在我國(guó)發(fā)病率為萬(wàn)分之五。多發(fā)性硬化病人的臨床表現(xiàn)癥狀主要有視神經(jīng)受損導(dǎo)致的視力下降，肢體行動(dòng)不協(xié)調(diào)，大小便失禁等。由于其癥狀較為嚴(yán)重而且容易復(fù)發(fā)所以日益受到廣泛的關(guān)注。
　　實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是模仿人類MS的經(jīng)典動(dòng)物模型。有研究表明CD4+CD25+ Treg細(xì)胞

4、在EAE小鼠神經(jīng)中樞高表達(dá)，并且通過(guò)局部免疫抑制調(diào)控EAE的發(fā)展。
　　Mof也叫MYST1，是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，它能將組蛋白H4的第16位賴氨酸(H4K16)乙?；?，Mof也可以乙酰化非組蛋白p53、TIP5等，乙?；梢约せ罨蜣D(zhuǎn)錄。Mof在正常的細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著不可替代的重要作用。研究表明Foxp3可以協(xié)助Mof完成激活靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。腫瘤壞死因子TGF-β在Mof的作用下刺

5、激Foxp3基因的活化，表達(dá)Foxp3。因此，研究Mof對(duì)Treg細(xì)胞的調(diào)控作用可以使我們更深入的了解自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制。
　　研究目的:
　　通過(guò)動(dòng)物模型即利用C57BL/6小鼠分別飲用3.5％的DSS溶液建立急性UC模型和體內(nèi)注射MOG35-55多肽抗原建立EAE模型。通過(guò)形態(tài)學(xué)，組織病理學(xué)，分子生物學(xué)，細(xì)胞化學(xué)等試驗(yàn)檢測(cè)方法，觀察UC發(fā)病小鼠腸黏膜組織與對(duì)照組相比發(fā)生的各種變化。對(duì)比EAE發(fā)病不同時(shí)期與正常組的區(qū)別

6、。進(jìn)而探討組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof在自身免疫病發(fā)病機(jī)制中的有關(guān)作用，為人類自身免疫疾病的預(yù)防與臨床治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　選取同一窩出生的且體重相近的6-8周的雌性C57BL/6小鼠作為材料，隨機(jī)且平均分成兩組，每組至少3只進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
　　1.選取其中兩組小鼠分別用于建立急性UC模型和EAE模型。
　　2.其中UC實(shí)驗(yàn)組分為DSS誘導(dǎo)3天和7天兩小組，收集相同部位的結(jié)腸組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);EAE

7、實(shí)驗(yàn)組分為發(fā)病初期、高峰期和緩解期三個(gè)時(shí)期，收集脾臟組織。
　　3.觀察正常組與UC實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸的區(qū)別和EAE實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組運(yùn)動(dòng)能力的區(qū)別，確定模型構(gòu)建成功。
　　4.細(xì)胞化學(xué)染色觀察DSS誘導(dǎo)3天和7天的組織病理學(xué)變化及嚴(yán)重程度。
　　5.結(jié)腸組織切片進(jìn)行免疫熒光雙染，觀察組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof和Tregs關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)情況，并進(jìn)行組織、細(xì)胞中的定位。
　　6.UC實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和EAE實(shí)驗(yàn)

8、組與對(duì)照組的組織分別用TRIzol裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，qPCR擴(kuò)增，定量分析炎癥有關(guān)基因與免疫因子的相對(duì)表達(dá)量。
　　7.從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠組織中提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分析Mof、Foxp3蛋白的表達(dá)變化情況。
　　8.Co-Immunoprecipitation(Co-IP)驗(yàn)證Mof與Foxp3有無(wú)物理上的相互作用。
　　9.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP-qPCR)實(shí)驗(yàn)分析小鼠組織中Mof在

9、特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合狀況，從而探討自身免疫病及炎癥的發(fā)病機(jī)制。
　　10.結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Mof,確定Mof對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.形態(tài)學(xué)觀察:分離C57BL/6小鼠的結(jié)腸組織，觀察UC實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，并且結(jié)腸有出血現(xiàn)象，且7天的組織變化更明顯，結(jié)腸內(nèi)部明顯的觀察到血便;EAE實(shí)驗(yàn)組小鼠行走緩慢，尾部無(wú)力，甚至出現(xiàn)雙后肢癱瘓。
　　2.組織的病

10、理切片:用蘇木精伊紅染色的方法鑒定，DSS飲用組小鼠的結(jié)腸粘膜層發(fā)生細(xì)胞凋亡，并伴有嚴(yán)重的黏膜脫落現(xiàn)象。
　　3.免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof表達(dá)于結(jié)腸組織固有層細(xì)胞的細(xì)胞核中，并且與Foxp3蛋白共定位。
　　4.Mof, Foxp3，I117，Tlr3，Tlr4，Tlr5，Tlr6，Tlr7，Tlr9 mRNA活性水平的變化，以18srRNA為參照，定量分析。DSS飲用7天的小鼠結(jié)腸組織其Mof，F(xiàn)oxp3，I

11、l17的mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，Tlr4，Tlr6，Tlr9 mRNA表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組。DSS飲用3天的小鼠結(jié)腸組織中，Mof, Foxp3，Il17的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EAE實(shí)驗(yàn)組Mof，F(xiàn)oxp3，I117的mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，且與發(fā)病程度呈正相關(guān)。Tlr4， Tlr5， Tlr7， Tlr9 mRNA表達(dá)水平也高于對(duì)照組。
　　5.SDS-PAGE凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)無(wú)論是UC實(shí)驗(yàn)組還是E

12、AE實(shí)驗(yàn)組組織中Mof、Foxp3蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組。
　　6.Co-IP實(shí)驗(yàn)表明Mof與Foxp3在體內(nèi)存在相互作用。
　　7.ChIP-qPCR結(jié)果表明Mof可以結(jié)合到Foxp3，Tlr3，Tlr4，Tlr5，Tlr6，RoRrt基因啟動(dòng)子區(qū)。
　　8.Mof過(guò)表達(dá)的HCT116細(xì)胞中，Tlr4蛋白和Foxp3蛋白表達(dá)量與對(duì)照組對(duì)比均明顯增加。qRT-PCR結(jié)果同樣證明了相似的結(jié)果。
　　結(jié)論:
　

13、　1、本研究運(yùn)用6-8周的C57BL/6小鼠作為材料，分別應(yīng)用DSS葡聚糖硫酸鈉(5000D)和MOG35-55多肽誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥和多發(fā)性硬化的發(fā)生，是一種建立潰瘍性結(jié)腸炎模型和實(shí)驗(yàn)性變態(tài)性腦脊髓炎模型的簡(jiǎn)便可靠的方法。這兩種模型可以用來(lái)研究人類炎性腸病的致炎機(jī)制及多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制。
　　2、本研究發(fā)現(xiàn)，除遺傳因素外，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof與潰瘍性結(jié)腸炎和多發(fā)性硬化癥的發(fā)病有一定的關(guān)系，Mof通過(guò)與Foxp3相互作用從而調(diào)節(jié)炎癥