豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因表達及重組蛋白ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovurus type 2,PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關疾病的重要病原.PCV2的ORF2基因不僅是其主要結構蛋白的編碼基因,而且也是區(qū)分PCV1和PCV2的重要區(qū)域,其編碼蛋白具有良好的抗原性.該研究利用PCR技術擴增出PCV2BF株ORF2基因,并進行了分子克隆,成功實現(xiàn)了ORF2基因大腸桿菌中的表達,對表達的重組蛋白進行了初步純化,利用純化的重組蛋白初步建立了檢測PCV2檢

2、測,完成6株PCV2分離毒株的全基因組序列測定與分析.1.參照GenBank發(fā)表的PCV2BF株基因序列,設計合成一對引物,對PCV2BF株ORF2基因進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,呈現(xiàn)一條約720bp的特異條帶,交其回收后克隆到pGEM T-Easy載體.根據(jù)基因分析,設計一對帶有酶切位點的引物,從克隆的pGEM T-ORF2重組質(zhì)粒擴增出大小為593bp的ORF2基因片段,然后克隆到表達載體pET-32a中,經(jīng)Xhol和

3、BamHI酶切鑒定,得到陽性重組表達質(zhì)粒pET-ORF2.2.將重組質(zhì)粒pET-ORF2轉化到表達宿主菌BL21(DE3)中,經(jīng)終濃度為2mmol/L的IPTG誘導,高效表達了ORF2基因編碼的結構蛋白,重組蛋白表達量占菌體蛋白量的20％.經(jīng)Western-Blot檢測表明,表達的重組蛋白能夠被PCV2陽性血清所識別,具有良好的抗原性.3.利用表達的重組融合蛋白作為抗原,建立了檢測PCV2抗體的間接ELISA方法,并對ELISA的反應條

4、件進行了摸索,確定了抗原的最適包被濃度為5μg/ml,最適包被條件為37℃1h加4℃過夜,檢測血清稀釋為1:40,HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為1:400.包被的重組蛋白不與豬瘟、豬偽狂犬病、豬日本乙型腦炎、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的陽性血清發(fā)生交叉反應,表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性.間接ELISA方法的建立為中國進行PCV2的診斷與監(jiān)測以及血清學調(diào)查提供了一處技術手段.4.采用PCR技術對中國北京、天津、山東、廣東