退變椎間盤炎性因子介導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及整合素α5β1轉(zhuǎn)導(dǎo)力學(xué)信號研究.pdf

1、本論文以力學(xué)因素為主要干預(yù)手段對大鼠尾椎間盤干預(yù)，運(yùn)用核磁共振(MRI)、TUNEL法、RT-PCR法、免疫熒光定量、流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡、Western Blot等各種方法對椎間盤退變的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，本研究共包括三個部分。
　　 第一部分大鼠尾椎間盤退變模型建立及影像學(xué)、組織形態(tài)學(xué)變化
　　 目的：建立一種新型力學(xué)因素誘導(dǎo)的大鼠尾椎間盤退變模型，通過影像和組織學(xué)觀測驗(yàn)證模型的可靠性。
　　 方法：24只

2、SD大鼠，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組12只，實(shí)驗(yàn)組大鼠用3.6％水合氯醛腹腔麻醉（10ml/Kg），安裝外固定架并按等同大鼠體重力量加壓，對照組不安裝外固定架。兩組分別于術(shù)前全部及術(shù)后2、4、8周各隨機(jī)抽取4只大鼠行MRI檢查，測量矢狀面T2WICo7～8、Co8～9和Co9～10椎間盤髓核MEANS值，采用椎間盤MRI評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行退變程度分度。在MRI檢查后，麻醉處死大鼠，取Co7～8、Co8～9和Co9～10椎間盤組織塊，甲醛固定

3、，HE染色、膠原蛋白免疫組化檢測。
　　 結(jié)果：MRI檢查：對照組椎間盤TIWI中低信號，T2WICo8～9髓核呈高信號。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周T2WICo8～9髓核信號降低，MEANS值降低。術(shù)后4周T2WI椎間隙變窄，Co8～9髓核信號明顯降低，MEANS值明顯降低。術(shù)后2、4、8周實(shí)驗(yàn)組與對照組T2像上Co8～9髓核MEANS值比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HE染色：對照組見髓核細(xì)胞數(shù)量多、排列均勻，纖維環(huán)各層排列整齊。實(shí)驗(yàn)

4、組Co8～9在術(shù)后2周見髓核細(xì)胞減少，纖維環(huán)排列紊亂。術(shù)后4周髓核細(xì)胞進(jìn)一步減少，出現(xiàn)成維樣細(xì)胞。8周髓核幾乎被纖維軟骨組織替代，纖維環(huán)排列不整齊，與髓核界限不清。免疫組化：對照組Co8～9髓核組織中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原染色呈規(guī)整網(wǎng)狀。實(shí)驗(yàn)組Co8～9髓核和纖維環(huán)術(shù)后4周、8周與對照組相比，Ⅱ型膠原染色變淺，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞。
　　 結(jié)論：在國內(nèi)首次構(gòu)建了外固定架固定應(yīng)力型椎間盤退變模型并首次采用MRI對鼠尾椎間盤退變進(jìn)行觀測。與國外

5、同類模型相比，外固定架固定四節(jié)段椎間盤退變模型消除了椎間盤退變的營養(yǎng)因素影響，為研究椎間盤退變的機(jī)理及治療方法提供了好的模型。
　　 第二部分退變椎間盤組織中IL-1β、MMP-2的表達(dá)與p38介導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡
　　 目的：通過對大鼠退變尾椎間盤組織中IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達(dá)的研究，探討IL-1β、MMP-2在椎間盤退變中的作用及其與p38介導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　 方法：椎間盤組織

6、HE染色：術(shù)后4周，對照組和實(shí)驗(yàn)組各隨機(jī)抽取5只大鼠，過量麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織（分離髓核和纖維環(huán)），甲醛溶液固定24h。標(biāo)本經(jīng)脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋后切片。TUNEL標(biāo)記檢測細(xì)胞凋亡：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)取5只大鼠，取出Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，TUNEL標(biāo)記檢測細(xì)胞凋亡。Quantitative Real-time PCR檢測IL-1β、MMP-2、CollagenⅡ基因：4周時(shí)兩組各隨機(jī)選15只，取出Co

7、8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，用PBS反復(fù)沖洗后立即置于Trizol溶液中用于熒光定量RT-PCR檢測。Western Blot檢測p38蛋白及其磷酸化水平：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)取大鼠5只，取Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)，蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)p38蛋白及其磷酸化水平。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組Co8～9術(shù)后4周可見髓核細(xì)胞密度增加，胞外基質(zhì)減少，纖維環(huán)排列紊亂。髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)為0.29，細(xì)胞凋亡指數(shù)兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜

8、0.05)。實(shí)驗(yàn)組髓核組織IL-1β的mRNA水平與對照組相比升高2.63±0.33倍(P＜0.05)，纖維環(huán)組織IL-1β的mRNA水平升高8.50±0.16倍(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組髓核組織MMP-2的mRNA水平與對照組相比則升高8.87±0.24倍(P＜0.05)；與對照組相比，CollagenⅡ在髓核和纖維環(huán)中下降至0.15±0.09倍和0.44±0.17倍(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組髓核組織p38蛋白含量表達(dá)與對照組比較無明顯差

9、異。p38蛋白磷酸化水平明顯升高，p-p38/β-actin比值對照組僅0.12±0.02，而實(shí)驗(yàn)組比值達(dá)0.63±0.05，兩者之間有明顯差異(P＜0.05)。椎間盤發(fā)生退變后p38蛋白磷酸化水平提高，p38蛋白活性增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：退變的椎間盤髓核細(xì)凋亡明顯增加，胞外基質(zhì)成分減少。實(shí)驗(yàn)組椎間盤組織中IL-1β的含量明顯高于正常組椎間盤組織，進(jìn)一步證實(shí)了IL-1β參與椎間盤的退變過程。此外，發(fā)現(xiàn)IL-1β表達(dá)量與MMP-2有

10、相關(guān)性，說明IL-1β在椎間盤退變過程中與MMP-2相互作用，共同促進(jìn)組織退變。在國內(nèi)首次證實(shí)退變椎間盤髓核細(xì)胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯增高，蛋白活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)凋亡。
　　 第三部分退變椎間盤整合素α5β1的表達(dá)及力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　 目的：在應(yīng)力加壓型椎間盤退變模型中，研究椎間盤組織內(nèi)整合素α5β1的表達(dá)、活化情況、檢測其下游信號分子變化，探討力學(xué)信號經(jīng)整合索α5β1轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能機(jī)制。
　　 方法：免疫組

11、織化學(xué)檢測組織中整合素α5定位及定量表達(dá)：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)抽取3只大鼠，過量麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織（分離髓核和纖維環(huán)，下同），甲醛溶液固定24h。石蠟切片采用免疫組化法檢測整合素α5定位及定量表達(dá)，切片光鏡觀察。免疫熒光檢測組織細(xì)胞表面整合素α5定位表達(dá)：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)抽取2只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織、固定、漂洗、孵育、滴加特異性一抗、二抗、漂洗、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、核甘油磷酸緩沖液封片，熒

12、光顯微鏡下鏡觀察。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞表面整合素α5β1定量表達(dá)：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)抽取15只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織，并用眼科剪剪碎至糊狀懸液，加入0.25%胰蛋白酶和0.2%膠原蛋白酶適量，消化組織懸液。通過尼龍網(wǎng)過濾成單細(xì)胞懸液。離心后加入50ml緩沖液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，需要時(shí)予臺盼藍(lán)(Trypan Blue)檢測細(xì)胞活性。采用間接標(biāo)記的一抗，加入整合素α5抗體，并加入FITC二抗冰上孵育，細(xì)胞熒光染色。Qua

13、ntitative Real-time PCR檢測整合素α5β1基因：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)抽取5只大鼠，麻醉處死，迅速取出Co8～9椎間盤組織，細(xì)胞總RNA用IRIzol抽提，以oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR green
　　 方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。Western Blot檢測FAK及其磷酸化水平：術(shù)后4周，兩組各隨機(jī)取5只大鼠，取Co8～9椎間盤髓核和纖維環(huán)。蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)FAK及其磷酸化水平

14、。
　　 結(jié)果：免疫組化染色顯示對照組髓核細(xì)胞表面有大量整合素α5表達(dá)，分布較均勻；實(shí)驗(yàn)組加壓4周后，退變的椎間盤髓核細(xì)胞散在分布，細(xì)胞表面染色不均。免疫熒光檢測見兩組髓核和纖維環(huán)細(xì)胞膜上均有整合素α5表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)減少、熒光強(qiáng)度減弱。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞表面整合素α5β1定量表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組髓核和纖維環(huán)組織流式細(xì)胞計(jì)數(shù)平均熒光強(qiáng)度下降，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組髓核組織整合素α5的mRNA水平與對照組相比

15、略升高，纖維環(huán)組織整合素α5稍下降；實(shí)驗(yàn)組髓核和纖維環(huán)組織整合素β1的mRNA水平比對照組略升高。但各組之間mRNA變化水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組髓核組織FAK蛋白含量表達(dá)與對照組比較無明顯差異。實(shí)驗(yàn)組FAK蛋白磷酸化水平明顯升高，p-FAK/β-actin比值對照組為0.15±0.07，而實(shí)驗(yàn)組比值0.42±0.11，兩者有明顯差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組椎間盤發(fā)生退變后p-FAK(FAK-Y397)表達(dá)明顯高于對照組