錨蛋白外翻誘發(fā)整合素αvβ3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞噬紅細(xì)胞作用.pdf

1、成熟的哺乳動物紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，缺乏合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的能力，其活動所需的能量依靠葡萄糖的酵解來供給，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)相對簡單，是研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能比較理想的模型之一。人紅細(xì)胞的平均壽命約為100～120天，在此期間，一個(gè)紅細(xì)胞可在組織和肺臟之間往返大約5～10萬次。紅細(xì)胞大約有1/4的生命期需要擠過狹窄的毛細(xì)血管，完成氧和二氧化碳的裝卸。紅細(xì)胞的雙凹碟盤形可以很好的適應(yīng)其所需要遭受的變形。經(jīng)過周期性的工作后，衰老的紅細(xì)胞主要被脾、肝、骨髓

2、等處的巨噬細(xì)胞吞噬分解。
　　 巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的識別主要通過其表面的受體來進(jìn)行的。巨噬細(xì)胞表面介導(dǎo)凋亡細(xì)胞識別及粘附的受體分子主要有玻璃粘連蛋白受體(整合素αvβ3)、磷脂酰絲氨酸受體、清道夫受體等。在對主要的紅細(xì)胞膜蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，α血影蛋白，錨蛋白和帶4.2蛋白都含有RGD(Arg-Gly-Asp)序列。RGD序列可以和約11種整合素結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間的粘附，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、分化和細(xì)胞凋亡。相關(guān)

3、報(bào)道中，更多提到的是RGD序列和整合素αvβ3之間的粘附。α血影蛋白和錨蛋白是保守性非常強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上具有舉足輕重的作用，因此，我們希望了解含有RGD序列的膜蛋白是否可以和整合素αvβ3發(fā)生相互作用，參與巨噬細(xì)胞對衰老或疾病紅細(xì)胞的識別。
　　 論文利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等對紅細(xì)胞膜蛋白在紅細(xì)胞程序性死亡過程中介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附行為進(jìn)行了系統(tǒng)研究。首先通過Far-Western blot技術(shù)，證實(shí)了紅細(xì)胞

4、囊泡中含有RGD序列的紅細(xì)胞膜蛋白中的一種或兩種膜蛋白能與整合素αvβ3產(chǎn)生相互作用。然而，錨蛋白和α血影蛋白分子量比較接近，分別采用純化的錨蛋白和血影蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果證明錨蛋白可以單獨(dú)與整合素αvβ3結(jié)合。考慮到免疫印跡實(shí)驗(yàn)中含有的去垢劑可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，論文采用了生物磁珠技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)與整合素間的結(jié)合能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在生理?xiàng)l件下，錨蛋白和整合素之間仍然有結(jié)合能力。
　　 錨蛋白是紅細(xì)胞膜內(nèi)在

5、蛋白，只有當(dāng)其位于細(xì)胞膜外側(cè)且RGD序列也暴露在蛋白質(zhì)表面時(shí)，才有可能被巨噬細(xì)胞表面的受體分子所識別。論文采用體外模擬實(shí)驗(yàn)對錨蛋白在紅細(xì)胞死亡過程中暴露到紅細(xì)胞膜的表面的機(jī)制進(jìn)行了研究，同時(shí)由于磷脂酰絲氨酸外翻是細(xì)胞程序性死亡過程中主要的“死亡信號”，對磷脂酰絲氨酸的外翻情況也做了相應(yīng)的檢測。結(jié)果表明：在外加流體剪切力和鈣離子的共同作用下，磷脂酰絲氨酸和錨蛋白均可以外翻到紅細(xì)胞表面，但熒光信號分布的差異表明錨蛋白的外翻機(jī)制可能不同于磷脂

6、酰絲氨酸。為了驗(yàn)證外翻的錨蛋白和整合素αvβ3的結(jié)合可以介導(dǎo)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附，論文采用了抑制實(shí)驗(yàn)，即用整合素αvβ3、annexinⅤ和錨蛋白封閉紅細(xì)胞膜上或巨噬細(xì)胞表面可能的結(jié)合位點(diǎn)后檢測紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附。結(jié)果表明，封閉相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)可以顯著降低巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞粘附的數(shù)量，錨蛋白的外翻可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的衰老紅細(xì)胞識別機(jī)制。
　　 論文還對正常紅細(xì)胞和基因敲除小鼠模型(帶3蛋白、錨蛋白、帶4.2蛋白及原肌球調(diào)節(jié)蛋白基因

7、敲除小鼠模型)的紅細(xì)胞在程序性死亡過程中力學(xué)及流變學(xué)參數(shù)、錨蛋白和磷脂酰絲氨酸的外翻信號進(jìn)行了檢測，對膜蛋白之間的相互作用及巨噬細(xì)胞對不同膜蛋白缺失的紅細(xì)胞識別能力的差異進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，在紅細(xì)胞程序性死亡過程中，帶4.2蛋白和原肌球調(diào)節(jié)蛋白基因敲除小鼠模型紅細(xì)胞的變形能力受到的影響最大，也就是說，這兩種膜蛋白缺失后的紅細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相對最差。與正常紅細(xì)胞相比，帶3蛋白和錨蛋白基因敲除小鼠模型的紅細(xì)胞的力學(xué)及流變學(xué)特性也受到

8、一定的影響。然而，錨蛋白基因敲除小鼠模型的紅細(xì)胞中，缺乏調(diào)節(jié)區(qū)域的錨蛋白外翻比例最高；帶3蛋白基因敲除小鼠模型的錨蛋白外翻比例相對最低。這個(gè)研究結(jié)果表明，錨蛋白調(diào)節(jié)區(qū)域部分或全部被切除可能更有利于其外翻，帶3蛋白和錨蛋白的連接對錨蛋白的外翻有至關(guān)重要的作用。
　　 綜上所述，本學(xué)位論文研究首次發(fā)現(xiàn)了在體外模擬紅細(xì)胞程序性死亡的過程中，膜內(nèi)在蛋白--錨蛋白在鈣離子和流體剪切力的作用下會暴露在細(xì)胞膜的表面，且可以被巨噬細(xì)胞受體分子-

9、-整合素αvβ3識別。錨蛋白和整合素αvβ3介導(dǎo)的衰老紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的粘附可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的衰老或疾病紅細(xì)胞識別機(jī)制。根據(jù)研究人員已發(fā)表的文獻(xiàn)及本論文的研究結(jié)果，我們推測錨蛋白的外翻步驟如下：
　　 1)剪切力作用造成細(xì)胞外鈣離子的大量涌入和紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的囊泡化，刺激細(xì)胞膜的不規(guī)則性，紅細(xì)胞程序性死亡被觸發(fā)；
　　 2)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度達(dá)到約10μM時(shí)會激活鈣調(diào)節(jié)蛋白酶和其他一些依賴鈣離子存在的酶類；
　　

10、 3)鈣調(diào)節(jié)蛋白首先水解錨蛋白，將錨蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)域C末端切去約20 kDa，導(dǎo)致錨蛋白和帶3蛋白、血影蛋白的結(jié)合力減弱80％；
　　 4)紅細(xì)胞在血管中穿行不斷的遭受流體剪切力的作用，而被部分水解的錨蛋白和其他膜蛋白的結(jié)合力減弱，部分錨蛋白在24個(gè)彈簧結(jié)構(gòu)的作用下被彈出磷脂雙分子層，RGD序列暴露在膜表面，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和衰老或疾病紅細(xì)胞的粘附。
　　 迄今為止，研究人員對紅細(xì)胞的成熟過程已有比較全面的了解，但紅細(xì)胞