Statin-caffeine抗流感病毒作用研究.pdf

1、研究目的： 本課題應(yīng)用不同流感病毒株(H5N1、H3N2、H1N1)，分別在細胞模型和動物模型觀察其體內(nèi)外抗病毒效果，并為抗病毒機制研究提供依據(jù)。 研究方法： (1)體外抗H1N1和H3N2流感病毒作用 本實驗采用MDCK細胞培養(yǎng)法進行體外抗流感病毒作用的實驗研究，分先感染病毒后加藥、先加藥后感染病毒兩種方法進行研究，藥物作梯度稀釋，每濃度4個復孔，同時設(shè)達菲陽性對照組，病毒對照組和正常細胞對照組。37℃

2、、5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)72h，每天用倒置顯微鏡觀察細胞病變(CPE)情況并記錄，據(jù)CPE實驗結(jié)果判斷藥物的作用效果。用Reed-Mueneh法計算藥物的半數(shù)有效濃度(EC50)。以藥物劑量的對數(shù)為橫坐標，以細胞CPE抑制率為縱坐標繪圖。探討不同給藥方式下，其量效關(guān)系曲線走勢，及藥物對流感病毒的抑制作用。 (2)構(gòu)建流感小鼠模型 分別構(gòu)建H5N1禽流感、H1N1和H3N2人流感小鼠模型。BALB／e小鼠隨機分組，以乙醚

3、輕度麻醉后，分別滴鼻感染H5N1、H1N1和H3N2流感病毒，每只10μl。并按不同的劑量(Statin 50μg/caffeine 200μg或Statin 25μg/caffeine 200μg)，不同的給藥方式(滴鼻或灌胃)、不同的處理方式(預防或治療)，觀察藥物在小鼠體內(nèi)的抗流感作用。同時設(shè)陽性對照、病毒對照和空白對照。從感染之日起，連續(xù)觀察14d，觀察小鼠的發(fā)病癥狀。 (3)肺組織病理檢測 在H3N2和

4、H1N1流感病毒動物實驗中，在病毒感染后第5天和14天，每組分別處死5只小鼠；在H5N1流感病毒動物實驗中，在病毒感染后第9和13天，每組分別處死5只小鼠。打開胸腔分別取氣管及肺臟，肉眼觀察記錄各組小鼠肺大體病變情況。并按常規(guī)方法做組織切片(HE染色)，在光學顯微鏡觀察各組動物肺及氣管的病理變化。 (4)熒光定量RT-PCR分析 用TRIZOL法提取肺組織中的RNA，檢測樣品的A260／280比值在1.8～2.0之間，采

5、用實時熒光定量RT-PCR方法檢測小鼠肺內(nèi)H3N2、H1N1、H5N1流感病毒核酸的量，探討藥物對流感病毒NP基因復制的抑制作用。 研究結(jié)果： (1)體外抗H1N1流感病毒作用 在病毒吸咐前和在病毒吸咐后用藥，statin／caffeine在體外均具有抗病毒活性，Caffeine、Statin、statin／caffeine、達菲的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為45.29／47.46ug／ml、10.39／10.

6、69ug／ml、30.23／30.56ug／ml和53.72／46.29ug／ml。且在不同的給藥方式下，其量效關(guān)系曲線走勢比較接近，說明藥物對流感病毒的抑制作用接近。聯(lián)合用藥組statin／caffeine在病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 (2)體外抗H3N2流感病毒作用 在病毒吸咐前和病毒吸咐后用藥，statin／caffeine在體外均具有較強的抗H3N2流感病毒的作用。caffeine、Statin、s

7、tatin／caffeine、達菲的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為45.72／46.76ug／ml、11.53／11.24ug／ml、30.29／33.50ug／ml和48.36／45.37ug／ml。且抑制H3N2流感病毒致細胞病變的作用都隨著藥物劑量的增加而增強，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強，且聯(lián)合用藥組statin／caffeine在病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 (3)體內(nèi)抗H5Nl流感病毒作用 H

8、5N1流感動物實驗中，statin 50μg／caffeine 200μg預防滴鼻組和達菲200μg治療灌胃組的肺組織病變程度相近。說明statin／caffeine對H5N1病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，與達菲灌胃的效果相似。與達菲200μg治療滴鼻組(J組)相比，statin 50μg／caffeine 200μg預防滴鼻組(A組)和馬抗-IgG預防滴鼻組(G組)的H5特異性病毒核酸量相對較低(P<0.05)，其他組

9、間無差別。結(jié)果提示，statin／caffeine能抑制H5N1流感病毒在肺臟的復制，且優(yōu)于達菲滴鼻的效果，與馬抗-IgG預防滴鼻的效果相似。 (4)體內(nèi)抗H3N2流感病毒作用 H3N2流感動物實驗中，與達菲200μg預防滴鼻組(Ⅰ組)相比，statin50μg／caffeine 200μg預防滴鼻(A組)和灌胃組(E組)、利巴韋林200μg預防滴鼻組(G組)和達菲200μg治療灌胃組(J組)的肺組織病變程度明顯減輕(P

10、<0.05)。同時，這些組間肺組織病變程度相近。說明statin／caffeine對H3N2病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，且優(yōu)于達菲滴鼻的效果，與達菲灌胃的效果相似。與statin 50μg／caffeine200μg預防灌胃組(E組)相比，statin 50μg／caffeine 200μg治療滴鼻組(B組)、statin 25μg/caffeine 200μg預防滴鼻組(C組)和治療滴鼻組(D組)、病毒唑200μg治

11、療灌胃組(H組)和達菲200μg預防滴鼻組(Ⅰ組)的H3特異性病毒核酸量相對較高(P<0.05)，其他組間無差別。提示聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine能抑制H3N2流感病毒在肺臟的復制，且優(yōu)于達菲滴鼻和病毒唑治療灌胃的效果，且聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine預防給藥的效果優(yōu)于治療給藥的效果，statm高劑量(50μg)的效果要優(yōu)于低劑量(25μg)的效果。 (5)體內(nèi)抗H1N1流感病毒作用 H1N1流感動物實

12、驗中，statin 50μg/caffeine 200μg治療滴鼻組(B組)和預防灌胃組(E組)與利巴韋林200μg預防滴鼻組(G組)和達菲200μg治療灌胃組(J組)的肺組織病變程度相近，提示聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine對H1N1流感病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，且與達菲和利巴韋林的效果相似。與利巴韋林200μg預防滴鼻組(G組)和達菲200μg治療灌胃組(J組)相似，statin 50μg／caffeine

13、200μg治療滴鼻組(B組)和預防灌胃組(E組)有相對高的Ct均值，說明這些組小鼠體內(nèi)的H1特異性病毒核酸量相對較低。 結(jié)果提示，聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine能抑制H1N1病毒在肺臟的復制，且預防和治療的效果均較好，與利巴韋林和達菲的效果相似。 結(jié)論： 1、聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine在體外有明顯的抗H3N2和H1N1流感病毒作用，其抑制流感病毒致細胞病變的作用隨著藥物劑量的增加而增強，且呈明

14、顯的量效關(guān)系，且病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 2、在流感動物實驗中，聯(lián)合應(yīng)用statin 50μg／caffeine 200μg可預防并緩解H5N1／H3N2／H1N1流感病毒感染的癥狀，有效抑制肺組織損傷，并抑制病毒在肺內(nèi)的復制，且效果相當于或優(yōu)于達菲。在H3N2流感動物實驗中，高劑量聯(lián)合用藥(statin50μg／caffeine200μg)的功效要高于低劑量聯(lián)合用藥(statin 25μg／caffeine 2