活化廣譜抗流感病毒中和抗體的組合疫苗研究.pdf

1、流感（influenza）是一種傳播于禽類和哺乳動物之間的呼吸道傳染病，在兒童、老人及高危人群中的死亡率很高。流感病毒疫苗(influenza virus vaccine)是預防流感的主要措施。盡管已開發(fā)和上市多種流感疫苗,但有效控制流感發(fā)病及蔓延仍面臨諸多挑戰(zhàn)，目前的疫苗僅能保護與所選疫苗候選株相同或相近的流感毒株感染，難以產生針對多種毒株或新發(fā)毒株的廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibodies，bnA

2、bs)。
　　目的：
　　本研究第一部分利用生物信息學，查詢2006-2009年PubMed所有流感病毒表面抗原血凝素(hemagglutinin,HA)的氨基酸序列，分析設計H1、H3和H5亞型的共有序列，分別命名為CON H1、CON H3和CON H5。該組序列以免疫原性極強HA的頭部序列為主，也包含相對保守但免疫原性較弱的莖部序列。本研究基于這些共有序列分別構建了3種DNA疫苗，經雙酶切和體外表達鑒定，分別命名為：p

3、VKD1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5，并用動物實驗檢測其免疫原性。
　　本研究第二部分模擬不同流感病毒多次感染宿主的自然狀態(tài)，除傳統混合免疫外，設計3種疫苗的序貫免疫接種方案，探索研發(fā)活化抗流感病毒廣譜中和抗體的新途徑。將實驗動物分為3組:序貫免疫組、混合免疫組和空載體組，檢測其免疫原性、血凝抑制(hemagglutination inhibition，HAI)效價及誘導廣譜中和抗

4、體的能力，并從序貫免疫小鼠制備流感病毒廣譜中和單克隆抗體,最后采用PR8病毒株行攻毒試驗檢測序貫免疫的保護作用。
　　方法：
　　一.流感病毒DNA疫苗的構建、鑒定及免疫原性檢測
　　應用back translation軟件，將H1、H3和H5亞型流感病毒的表面抗原血凝素的共有序列密碼子優(yōu)化為哺乳動物密碼子核酸序列，分別命名為CON H1、CON H3和CON H5。在它們前端加入酶切位點，尾端加入終止密碼子和相應的酶

5、切位點后進行序列合成。將人工合成的共有序列插入質粒pVKD1.0構建疫苗pVKD1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5。用SalI和EcoRⅤ、EcoRⅤ和EcoR I及SalⅠ和BamHⅠ行雙酶切鑒定。分別以Lipofectamine2000TM法轉染293T細胞，培養(yǎng)24小時后用免疫印跡法（Western Blotting，WB）檢測蛋白表達。
　　用動物模型檢測3種疫苗的免疫原性。將

6、BALB/c小鼠分為四組：空載體組3只，疫苗免疫組各5只。分別在0、2和4周于右側脛前肌注射空載體或相應的疫苗100μg，于第6周將小鼠麻醉后眼內眥取血，頸椎脫臼處死并分離提取脾細胞。分離的小鼠脾淋巴細胞以合成肽HA533(IYSTVASSL)和HA438(SYNAELLVAL)作為刺激原，用酶聯免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)檢測每106個脾細胞中產生 INF-γ的脾細胞數；用

7、酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測小鼠血清對滅活流感病毒株Br07 H1、BR07 H3和HK97 H5的結合抗體滴度。以上實驗組分別與空載體組進行比較并作t檢驗。
　　二．疫苗序貫免疫的免疫原性、HAI效價和誘導廣譜中和抗體的檢測及攻毒試驗
　　將BALB/c小鼠分為三組，序貫免疫組、混合免疫組和空載對照組。序貫免疫組分別在0、4、8周于右側脛前肌注射pVK

8、D1.0-CON H1、pVKD1.0-CON H3和pVKD1.0-CON H5疫苗各100μg；混合免疫組則每次注射3種疫苗的混合液99μg(每種33μg),空載組每次注射空載體100μg。于第10周將小鼠麻醉后眼內眥取血后頸椎脫臼法處死并分離提取脾細胞。
　　細胞免疫原性檢測采用ELISPOT法，以合成肽HA533(IYSTVASSL)作為刺激原檢測產生INF-γ的脾細胞數。體液免疫原性檢測采用ELISA法，分別檢測小鼠血清

9、對H1（BR07 H1、TJ09 H1和SH09 H1）、H3（BR07 H3）和H5（HK97 H5和NV05 H5）亞型滅活病毒株的HA抗體效價。HAI試驗分別采用4株滅活的流感病毒株——2株H1亞型（TJ09 H1、SH09 H1）、1株H3亞型（SH09 H3）和1株H5亞型（NV05 H5），檢測血凝抑制效價。中和試驗采用H1(TE09 H1、SI06 H1、SI86 H1和BR07 H1)、H3(MO99 H3、FJ02 H

10、3、WI05 H3和BR07 H3)和H5(VN04 H5)亞型的假病毒株，檢測小鼠血清中和抗體效價。為了檢測抗體的中和活性是否由免疫球蛋白G（IgG）介導，各取2只實驗組小鼠血清，檢測剔除IgG前后的中和抗體滴度。
　　為制備單克隆抗體，另選5只BALB/c小鼠同前行序貫免疫接種，末次接種后2周處死小鼠收集脾細胞，將其與SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞系融合，通過中和試驗逐個篩選3200個雜交瘤細胞系,經過2次確認，最終通過SC1

11、8 H1假病毒株篩選分離出2種強效廣譜中和性單克隆抗體。
　　為確認序貫免疫的保護作用，選用PR8流感病毒株，通過鼻內滴注致死量病毒，分別感染經序貫免疫、混合免疫和空載組免疫后2周的小鼠，檢測感染后14天之內各組小鼠體重變化和生存情況。
　　結果：
　　一．流感病毒DNA疫苗的構建、鑒定及免疫原性檢測
　　1.質粒雙酶切鑒定
　　酶切產物電泳后在5kb均可見與pVKD1.0載體片斷相等條帶，重組質粒電泳條帶

12、約為7kb,與預期的插入基因片段2kb大小相符。
　　2.蛋白表達鑒定
　　將重組DNA疫苗轉染293T細胞后進行SDS-PAGE電泳和WB檢測，結果顯示約在90kD處可見預期蛋白條帶。
　　3.細胞免疫原性檢測
　　疫苗免疫后處死小鼠分離脾細胞，用肽 HA533(IYSTVASSL)刺激后，pVKD-CON H1和pVKD-CON H5組IFN-γ斑點形成細胞（Spot forming cells，SFCs）數

13、與空載組差異有顯著性（P<0.01）,pVKD-CON H3組IFN-γSFCs數與空載組無顯著性差異。用肽HA438(SYNAELLVAL)刺激后，pVKD-CON H3組與空載組IFN-γSFCs數差異具有顯著性（P<0.05），pVKD-CON H1和pVKD-CON H5組與空載組無顯著差異。
　　4.體液免疫原性檢測
　　免疫后小鼠血清中針對BR07 H1的抗體結果顯示，pVKD1.0-CON H1和pVKD1.0

14、-CON H5組與空載組間血清抗體滴度差異具統計學意義（P<0.01），pVKD1.0-CON H3組與空載組間差異無統計學意義。針對BR07 H3的抗體結果顯示，pVKD1.0-CON H3組與空載組間抗體滴度差異具顯著統計學意義（P<0.01），其余實驗組與空載組間抗體滴度差異無統計學意義。針對HK97 H5的抗體結果顯示，pVKD1.0-CON H5組與空載組間抗體滴度差異具顯著統計學意義（P<0.01），其余實驗組與空載組間抗體

15、滴度差異無統計學意義。
　　二．疫苗序貫免疫的免疫原性、血凝抑制能力、誘導廣譜中和抗體的檢測及攻毒試驗
　　1.細胞免疫原性檢測
　　基于IFN-γ和優(yōu)勢表位肽HA533(IYSTVASSL)的ELISPOT法結果：每106個脾細胞的SFCs，空載組、序貫免疫組和混合免疫組分別為11±5、948±54和985±192。序貫免疫組和混合免疫組與空載組均有顯著差異(P<0.01)；序貫免疫組和混合免疫組間差異無統計學意義。

16、
　　2.體液免疫原性檢測
　　(1)H1亞型的檢測結果:針對與CON H1同源性相對較高的SH09 H1，序貫免疫組和混合免疫組的抗體滴度均高于空載體對照組(P<0.01）,混合組高于序貫組（P<0.01）。針對TJ09 H1，序貫免疫組的和混合免疫組誘導的抗體滴度和空載體組對比均無差異(P>0.05)。針對與CON H1同源性相對較低的BR07 H1，序貫免疫組和混合免疫組的抗體滴度均高于空載體組（P<0.01），且序貫

17、免疫組高于混合免疫組（P<0.05）。
　　(2)H3亞型的檢測結果:針對BR07 H3，序貫免疫組和混合免疫組的抗體滴度與空載組比較均有統計學意義（P<0.01）。
　　(3)H5亞型的檢測結果：針對HK97 H5和NV05 H5，序貫免疫組和混合免疫組的抗體滴度和空載體組比較均有差異(P<0.05，P<0.01)，混合組均高于序貫組（P<0.01)。
　　3. HAI抗體反應效價的測定
　　采用的4個滅活病毒

18、株，除TJ09 H1，針對其他3個流感病毒株均誘導出較強的HAI反應。針對SH09 H1，實驗組誘導抗體滴度均高于空載組(P<0.01)，混合組優(yōu)于序貫組(P<0.01)。針對SH09 H3實驗組的血凝抑制效價均顯著高于空載組(P<0.01)，實驗組之間均無差異。針對NV05 H5實驗組血凝抑制效價均顯著高于空載組（(P<0.05)，(P<0.01)），實驗組之間均無差異。
　　4.序貫免疫誘導廣譜中和抗體反應的檢測及抗體型別鑒定

19、
　　用于中和實驗的假病毒株基于以往建立的假病毒平臺，包括H1、H3、H5以及部分其它型別。
　　(1)針對H1亞型的bnAbs反應檢測：針對與CON H1同源性相對較高的TE09 H1，實驗組和空載組之間均有顯著差異（P<0.01），序貫免疫組的nAbs稍低于混合免疫組，兩者之間無統計學差異。針對其他3種與CON H1同源性相對較低的H1亞型毒株，混合免疫組幾乎不產生中和抗體免疫，而序貫免疫組仍可產生一定量的中和抗體,和空

20、載體組的差異均具統計學意義（P<0.01），序貫組顯著優(yōu)于混合組。
　　(2)針對H3亞型的nAbs反應檢測：BR07 H3和CON H3同源性最高，與空載組比較實驗組均產生顯著的nAbs反應（P<0.01），實驗組之間無差異。MO99 H3、FJ02 H3和WI05 H3同源性相對較低，序貫組產生的抗體滴度均高于混合組，其中針對同源性最低的MO99 H3，實驗組之間的差異具統計學意義(P<0.05)，而針對WI05 H3，實驗組

21、之間有顯著差異(P<0.01)。
　　(3)針對H5亞型的nAbs反應檢測：采用的病毒株VN04 H5和NV05 H5與CON H5的同源性均較高，實驗組均產生了較高的nAbs滴度，混合組高于序貫組，差異均具統計學意義(P<0.01)。
　　(4)中和抗體型別鑒定：對比血清樣本在用蛋白G瓊脂糖珠剔除IgG前后的nAbs滴度，結果顯示IgG剔除后血清樣本對所有病毒株均無中和活性，包括之前顯示中和活性較強的TE09 H1，BR0

22、7 H3和 VN04 H5，這一結果確認流感病毒疫苗的中和活性主要由IgG介導。
　　5.廣譜單克隆抗體分離
　　最終通過SC18 H1假病毒株篩選分離出2種強效廣譜中和性單克隆抗體：5A3-F1、5A3-F2，具有針對試驗中所有H1和H5亞型以及部分H3亞型病毒的廣譜中和活性，半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）達到了微克級，尤其是針對SC18 H1和TE09

23、 H1的IC50分別低至96.9 ng/mL和11.1 ng/mL。中和H5亞型病毒的活性也可達微克級。另外，針對FJ02 H3,5A3-F1的IC50值為1.0μg/mL，5A3-F2的IC50值為0.5μg/mL。5A3-F2甚至具有抗H8亞型病毒的較弱的中和活性。而對于其他亞型，5A3-F1和5A3-F2均無中和活性。
　　6.攻毒試驗結果
　　用和2009H1N1大流行病毒株TE09H1之間有交叉反應的PR8病毒株，

24、致死量感染后，空載組小鼠在第14天僅1只小鼠存活，所有小鼠體重均大幅下降；而混合組小鼠全部得到保護，優(yōu)于序貫組(序貫組有一只小鼠死亡)，大多數疫苗免疫后小鼠體重都有所恢復。
　　結論：
　　本課題利用流感病毒H1、H3和H5亞型的共有序列構建的流感病毒DNA疫苗和動物模型，模擬人類感染流感病毒的自然過程。應用流感病毒DNA疫苗序貫免疫接種策略，依據全亞型流感毒株的中和抗體評價指標,探索誘導活化更廣譜高效中和抗體的新途徑。得出