中國HIV-1廣譜高效中和抗體篩查研究.pdf

1、目的:據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，至2009年全球共有約3330萬HIV/AIDS患者，2009年一年HIV新增加感染者260多萬例。我國HIV/AIDS感染報(bào)告例數(shù)由2000年的每年5000多例增加到2009年的每年68000多例，防治形勢十分嚴(yán)峻，迫切需要研發(fā)保護(hù)性艾滋疫苗。中和抗體是可與病毒結(jié)合并消除其感染能力的抗體，可對(duì)HIV-1感染提供保護(hù)作用。由于HIV-1基因的高度可變性，成功的艾滋疫苗須能引發(fā)HIV-1廣譜中和抗體，即可廣譜中和

2、HIV-1主要流行病毒亞型的抗體。
　　 國外約有10％-30％的HIV-1慢性感染者可產(chǎn)生廣譜中和抗體反應(yīng)，能產(chǎn)生對(duì)各種主要啞型均高效的中和抗體更是少之又少。為獲得廣譜高效中和抗體，美國有研究者使用假病毒技術(shù)篩查了1798份來自于不同國家和地區(qū)（不包含中國）的HIV-1慢性感染者血清/血漿，僅1％的血清/血漿具有廣譜高效中和活性。與國外相比，國內(nèi)尚無HIV-1廣譜高效中和抗體的大規(guī)模篩查報(bào)道。國內(nèi)使用假病毒技術(shù)分別研究了HIV

3、-1B′亞型慢性感染者和中國長期不進(jìn)展人群的廣譜中和抗體水平，但前者研究亞型單一，后者研究人群局限。雖有研究評(píng)價(jià)了中國4個(gè)地區(qū)3個(gè)亞型的34例HIV-1慢性感染者的廣譜中和抗體水平，但例數(shù)過少，無法明確中國地區(qū)HIV-1慢性感染者人群廣譜中和抗體的存在狀況及特點(diǎn)。從具有廣譜高效中和活性的血漿中已分離出部分單克隆廣譜中和抗體，通過對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)病毒的一些中和位點(diǎn)，有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HIV-1疫苗免疫原設(shè)計(jì)中的潛在作用靶位。隨著可中

4、和50％以上HiV-1流行株的新單抗(PG9，PGi6)的發(fā)現(xiàn)，新的HIV-1疫苗作用靶位也隨之被發(fā)現(xiàn)。迄今為止從HIV-1感染者中分離到的中和活性最強(qiáng)、中和譜最廣的中和抗體是VRC01，它可中和90％以上中國以外地區(qū)的HIV-1流行株，但無法中和多數(shù)中國地區(qū)主要流行株。我國的HIV-1疫苗設(shè)計(jì)需要依據(jù)本國HIV-1感染者的廣譜高效中和抗體，迫切需要對(duì)中國HIV-1慢性感染者進(jìn)行篩查，獲得我國具有廣譜高效中和活性的病例，發(fā)現(xiàn)新的HIV-

5、1廣譜單克隆抗體，為設(shè)計(jì)適合我國HIV-1感染者的艾滋疫苗提供依據(jù)。
　　 本研究選用B、C、CRF01-AE和CRF07/08_B/C亞型假病毒建立了一個(gè)HIV-1廣譜高效中和抗體篩查系統(tǒng)，篩查了中國5個(gè)主要流行地區(qū)4個(gè)主要流行亞型的HIV-1慢性感染者血漿，明確中國HIV-1廣譜中和抗體存在狀況及特點(diǎn)，篩選具有廣譜高效中和抗體的病例，為中國HIV-1廣譜高效單克隆抗體研究及疫苗開發(fā)提供有力支持。
　　 方法:

6、　　 1、研究對(duì)象:未接受HAART治療、至采血日期感染時(shí)間≥1年的HIV-1慢性感染者320例。其中新疆47例(14.69％)，河南159例(49.69％)，吉林34例(1O．63％)，云南56例(17.50％)，遼寧24例(7.50％)。HIV-1B亞型211例，C亞型17例，CRF01_AE亞型10例，CRF07/08B/C亞型54例，其它（包括其它亞型和亞型不詳者）28例。每例采集EDTA抗凝的血漿2ml，-80℃凍存。

7、>　　 2、CD4+T細(xì)胞絕對(duì)值的檢測:20μlCD4/CD8/CD3TriTEST試劑加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，用FACSMMLTISET軟件檢測并進(jìn)行自動(dòng)分析，得到CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。
　　 3、病毒載量測定:以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1 Monitor1.5commercialkit

8、在COBAS AMPLICOR自動(dòng)載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。檢測范圍為400-750，000copies/ml。
　　 4、假病毒檢測盤1和2的建立:假病毒檢測盤1由8個(gè)假病毒組成，其中HIV-1B亞型3個(gè)，C亞型3個(gè)，CRF01-AE亞型2個(gè)。假病毒檢測盤2由25個(gè)假病毒組成，其中B亞型7個(gè)，C亞型7個(gè)，CRF01AE亞型4個(gè)，CRF07/08_B/C亞型5個(gè)，對(duì)照組假病毒2個(gè)。
　　 5、功能性假病毒的

9、獲得和滴定:將質(zhì)粒pSV7d（已連接env基因）和pSG3△env（含有HIV基因組中除env之外的所有基因）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48-72h。收集培養(yǎng)上清過濾，-80℃凍存。假病毒做1：5稀釋，8個(gè)梯度，4復(fù)孔。計(jì)數(shù)TZM-bl細(xì)胞，每孔加入104個(gè)細(xì)胞，加入DEAE-dextran，終濃度30μg/ml。37℃，5％CO2培養(yǎng)48h后吸棄150μl液體，加入100μ1熒光素酶檢測試劑。2min后移入

10、96孔黑板中讀取發(fā)光值，使用Spearman-Karber公式計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。
　　 6、假病毒檢測盤1的中和檢測和計(jì)算方法:血漿100倍稀釋，加入50TCID假病毒，37℃孵育1h后每孔加入104TZM-bl細(xì)胞，37℃，5％C02培養(yǎng)48h后吸棄150μ1液體，加入100μ1熒光素酶檢測試劑。2min后移入96孔黑板中讀取發(fā)光值，計(jì)算中和抑制率。中和抑制率為血漿100倍稀釋后對(duì)假病毒感染的抑制率。中

11、和抑制率計(jì)算公式為1-（標(biāo)本孔發(fā)光值-細(xì)胞對(duì)照孔發(fā)光值）/（假病毒對(duì)照孔發(fā)光值-細(xì)胞對(duì)照孔發(fā)光值）。某亞型假病毒組中和抑制率即指該亞型組內(nèi)各假病毒中和抑制率的平均值，總體中和抑制率為B、C、CRF01 AE三個(gè)亞型組中和抑制率均值的平均值。
　　 7、假病毒檢測盤2的中和檢測和計(jì)算方法:血漿起始稀釋倍數(shù)45，1：3系列稀釋，加入50TCID假病毒，37℃孵育1h后每孔加入104細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)48h后吸棄150μ1液

12、體，加入100μl熒光素酶檢測試劑。2min后移入96孔黑板中讀取發(fā)光值，計(jì)算ID50。ID50為抑制病毒50％感染時(shí)的血漿稀釋倍數(shù)。使用Luc5Samples02NotLockedl.xls和Origin8統(tǒng)計(jì)軟件中的非線性曲線擬合來進(jìn)行計(jì)算。
　　 8、中和活性的評(píng)價(jià)指標(biāo):本研究中假病毒檢測盤1中，中和寬度和中和抑制率反映血漿中和活性的強(qiáng)弱，假病毒檢測盤2中，主要由中和寬度、ID50、幾何平均滴度（ID50的幾何平均值）和中

13、和評(píng)分反映血漿中和活性的強(qiáng)弱。若血漿針對(duì)某個(gè)假病毒中和抑制率≥50％，即認(rèn)為可中和該假病毒。若某血漿可中和某個(gè)亞型組中至少一個(gè)假病毒，即認(rèn)為可中和該亞型組。總體中和寬度定義為血漿可中和的亞型組個(gè)數(shù)，亞型組中和寬度則為血漿可中和該亞型組內(nèi)的假病毒個(gè)數(shù)。通過Y=Log3(ID50/100)+1這一公式（＜45者給予ID50為33以便于計(jì)算）分別進(jìn)行計(jì)算，賦予假病毒SF162、假病毒MLV權(quán)重皆為0，其余假病毒權(quán)重相等，計(jì)算其加權(quán)平均值即為中

14、和評(píng)分。廣譜高效血漿確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)：該血漿至少能夠中和5個(gè)假病毒亞型組中的4個(gè)，且平均每個(gè)亞型組內(nèi)ID5o≥300的假病毒個(gè)數(shù)≥2。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件和Origin8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；用Spearman等級(jí)秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析；使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、假病毒檢測盤1檢測結(jié)果
　　 1、中和寬度和中和抑制

15、率分析：為評(píng)價(jià)假病毒檢測盤1中血漿的中和活性，對(duì)其中和寬度和中和抑制率進(jìn)行了分析。35％的血漿總體中和寬度為3，B和C亞型組中和寬度正相關(guān)，總體中和寬度與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、病毒載量水平無相關(guān)。云南B亞型血漿的C亞型組中和寬度高于遼寧、河南、吉林。B亞型假病毒組中和抑制率均值為0.47±0.30;C亞型假病毒組中和抑制率均值為0.40±0.32;CRF01_AE亞型假病毒組中和抑制率均值為0.31±0.30;總體中和抑制率均值為0.39

16、±0.22?？傮w中和抑制率和感染時(shí)間正相關(guān)。對(duì)于B亞型血漿來說，云南總體中和寬度高于遼寧；遼寧、河南,感染時(shí)間高于云南；云南總體中和抑制率顯著高于河南、遼寧、吉林;B業(yè)型假病毒組中和抑制率顯著高于C和CRF01_AE亞型。
　　 2、血漿篩選結(jié)果：320例血漿，能夠中和6個(gè)以上假病毒的血漿45例(14.1％)：7個(gè)以上22例(6.9％)；能夠中和全部8個(gè)假病毒的血漿10例(3.1％)。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過最初篩選后，約有5％血漿進(jìn)入最

17、終篩選，本次研究若選擇可中和6個(gè)以上假病毒的血漿進(jìn)入假病毒檢測盤2，為45例(14.1％)，與“5％”差距過大；若選擇可中和全部8個(gè)假病毒的血漿進(jìn)入假病毒檢測盤2，則僅為10例(3.1％)，比例過小，易漏查具有廣譜高效中和活性的血漿；故選擇可中和7個(gè)以上假病毒的血漿進(jìn)入假病毒檢測盤2，為22例(6.9％)，與“5％”差距最小。22例血漿經(jīng)假病毒VSV-G檢測，計(jì)算50倍稀釋后對(duì)假病毒感染的抑制率，結(jié)果均≤40％，排除服藥可能。22例中河

18、南7例(31.8％)；云南6例(27.3％)：吉林4例(18.2％)；新疆5例(22.7％)；B′亞型12例，C亞型4例，CRF07_B/C亞型5例，亞型不詳1例；中和寬度均為3。感染時(shí)間＞10年的12例(54.5％)；5-10年的3例(13.6％)；＜5年的2例(9.1％)；感染時(shí)間不詳?shù)_認(rèn)≥1年的5例(22.7％)。
　　 二、假病毒檢測盤2檢測結(jié)果
　　 1、幾何平均滴度分析：云南血漿幾何平均滴度均值為312±1

19、84.7，新疆為125±44.6，河南為104±35.7，吉林為102±33.3。云南血漿幾何平均滴度顯著高于新疆，河南和吉林。
　　 2、血漿篩選結(jié)果：中和評(píng)分≥2的3例(13.6％)；≥1且＜2的11例(50.0％)；其余8例均＜1(36.4％)；15例可中和假病毒檢測盤2上全部5個(gè)亞型假病毒組，其余7例可中和假病毒檢測盤2上4個(gè)亞型假病毒組。其中3例(YN043、YN014、YN025)具有HIV-1廣譜高效中和活性，都來

20、自中國云南德宏地區(qū)，可中和假病毒檢測盤2上全部5個(gè)亞型假病毒組，約占血漿總量的1％，均為男性。其中YN043為HIV-1C亞型，中和評(píng)分為2.64，幾何平均滴度為603，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)為358，病毒載量為23000，傳播途徑為IDU，采血時(shí)間為2006年，采血時(shí)年齡25歲，可中和23個(gè)假病毒，于2009年3月16日開始HAART治療，至今存活；YN014為HIV-1C亞型，中和評(píng)分為2.34，幾何平均滴度為435，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)

21、為526，病毒載量為27600，傳播途徑為IDU，采血時(shí)間為2006年，采血時(shí)年齡36歲，可中和21個(gè)假病毒，已死亡；YN025為HIV-1B′亞型，中和評(píng)分為2.12，幾何平均滴度為343，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)為366，病毒載量為9570，傳播途徑為hetero，采血時(shí)間為2006年，采血時(shí)年齡25歲，可中和21個(gè)假病毒，未治療，已失訪。
　　 結(jié)論：
　　 1、中國HIV-1慢性感染者人群中約有35％具有HIV-1廣譜