靶向HIV-1的高效多靶點(diǎn)RNAi元件的研究.pdf

1、艾滋病已成為一場(chǎng)人類、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的災(zāi)難,對(duì)個(gè)人、社區(qū)和國(guó)家都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。目前常用的艾滋病治療方法是化學(xué)藥物的雞尾酒療法,該方法可明顯降低患者體內(nèi)的病毒載量,控制病情的發(fā)展。然而,該方法并不能達(dá)到治愈艾滋病的效果,急需開發(fā)新的更為有效的治療方法。RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的機(jī)制,目前已在HIV-1的抗病毒研究中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。然而,HIV-1具有的高突變率使得病毒很容易逃避傳統(tǒng)的單靶點(diǎn)RNAi的

2、抑制。多靶點(diǎn)策略是克服病毒突變逃避抑制的有效方法,本研究的目的即在于篩選靶向HIV-1的高效的RNAi靶點(diǎn)并通過人工簇狀miRNA結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗病毒siRNA的共表達(dá),以獲得更為理想的抗病毒效果,為進(jìn)一步應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行新型艾滋病治療方法的研究提供重要的基礎(chǔ)。
　　 本研究首先通過規(guī)?；Y選獲得靶向HIV-1的兼具高抑制效率和高保守性特征的RNAi靶位點(diǎn)。以HIV-1NL4-3為靶序列選擇設(shè)計(jì)了153個(gè)siRNA,主要分別靶

3、向gag、pol、vif,vpu基因,在pSUPER質(zhì)粒上構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。各shRNA表達(dá)質(zhì)粒分別與HIV-1感染性克隆pNL4-3共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HIV-1編碼蛋白p24的活性,篩選出具有高抑制效率的RNAi靶序列。同時(shí)通過保守性分析、干擾素免疫反應(yīng)的檢測(cè)及進(jìn)一步的對(duì)多亞型病毒的抑制效率實(shí)驗(yàn)篩選獲得4個(gè)兼具高抑制率和高保守性特征的RNAi靶位點(diǎn),分別為po11102和po11026(靶向po

4、l基因),vif37和vif9(靶向vif基因)。將RNAi的靶序列插入到熒光素酶基因的3'UTR區(qū),構(gòu)建了一系列的報(bào)告質(zhì)粒。pSUPER-shRNA分別與對(duì)應(yīng)的報(bào)告質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染,po11102、po11026、vif37和vif9僅僅抑制含有相應(yīng)靶序列的報(bào)告基因的表達(dá),證明了抑制效果的特異性。本研究進(jìn)一步選擇Do11102和vif37靶點(diǎn)分別構(gòu)建shRNA表達(dá)元件及通過化學(xué)方法合成siRNA驗(yàn)證其在細(xì)胞感染模型中的抗HIV-1的能力。

5、MT-4是能夠支持HIV-1體外復(fù)制的T淋巴細(xì)胞系。本研究構(gòu)建了攜帶靶向po11102和vif37靶點(diǎn)的shRNA表達(dá)元件的重組慢病毒載體,轉(zhuǎn)導(dǎo)MT-4細(xì)胞分別篩選獲得了可穩(wěn)定表達(dá)靶向po11102和vif37靶點(diǎn)的siRNA的細(xì)胞株,攻毒實(shí)驗(yàn)顯示上述細(xì)胞株可有效抑制HIV-1的感染和復(fù)制。本研究通過化學(xué)方法進(jìn)一步合成了靶向vif37靶點(diǎn)的siRNA,分別采用不修飾、甲氧基修飾、膽固醇修飾的合成方式,檢測(cè)結(jié)果顯示3種修飾方式合成的siR

6、NA均能夠有效抑制HIV-1的復(fù)制表達(dá),其半數(shù)抑制劑量(ED50)分別為1nmol、1nmol、2nmol。
　　 本研究顯示對(duì)穩(wěn)定表達(dá)靶向po11102和vif37靶點(diǎn)的siRNA的MT-4細(xì)胞株進(jìn)行長(zhǎng)期連續(xù)攻毒實(shí)驗(yàn)可獲得逃避抑制的突變病毒,本研究對(duì)11株vif37靶點(diǎn)的突變株進(jìn)行了靶點(diǎn)區(qū)域的測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)病毒突變集中于RNAi靶點(diǎn)區(qū)中部的兩個(gè)位點(diǎn),突變方式主要是同義突變或者同類氨基酸替換。該結(jié)果這說明單靶點(diǎn)策略是不足以應(yīng)對(duì)H

7、IV-1的突變逃避的,采用多靶點(diǎn)抑制策略是十分必要的。天然miRNA中存在少量的簇狀結(jié)構(gòu),一個(gè)順反子經(jīng)過剪切、加工后可以得到多個(gè)不同的成熟miRNA,本研究探索采用以天然miRNA基因簇骨架構(gòu)建多靶點(diǎn)RNAi元件。以天然簇狀miRNA(miR-17-92)為骨架,將其中的miRNA序列(miRNA17、18、19a、20、和19b-1)分別替換為siP24、siPOL、siVIF1、siVIF2、siTAT的序列,得到可同時(shí)表達(dá)5個(gè)抗病

8、毒siRNA的簇狀miRNA結(jié)構(gòu)BHS。BHS分別與含靶點(diǎn)序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示5個(gè)siRNA中只有siTAT較好的保持了抑制效果,并沒有達(dá)到同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗病毒siRNA的目的。本研究還嘗試將兩個(gè)有效的抗病毒miRNA前體直接相連,構(gòu)建2靶點(diǎn)RNAi表達(dá)結(jié)構(gòu),但是兩個(gè)靶點(diǎn)中只有一個(gè)較好的保持了抑制效果。
　　 分析了上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并考慮到HIV-1的基因組中含有天然的miRNA,本研究重新設(shè)計(jì)了構(gòu)建多靶點(diǎn)RNAi

9、元件的策略,以源自HIV-1的反義RNA序列作為連接序列,采用靈活的克隆構(gòu)建方法,將多個(gè)抗病毒miRNA以不同的組合和順序連接起來,得到不同的人工簇狀miRNA結(jié)構(gòu),用實(shí)驗(yàn)的方法從中選出有多靶點(diǎn)RNAi效果的表達(dá)結(jié)構(gòu)。通過以天然的miRNA(miR-30a或miR-155)為骨架構(gòu)建靶向HIV-1的19011102、po11026、po11402、vif9和vif37靶點(diǎn)的miRNA元件,采用與HIV-1感染性克隆共轉(zhuǎn)染的方式檢驗(yàn)獲得有

10、效的單個(gè)miRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)。在獲得有效的單個(gè)miRNA元件序列的下游添加一段HIV-1反義RNA構(gòu)成的連接序列,組成一個(gè)包含miRNA前體和連接序列的串聯(lián)單元,并用共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因的方式,選擇具有抑制效果的單元進(jìn)行后續(xù)的多靶點(diǎn)元件組合實(shí)驗(yàn)。將獲得的靶向po11402、po11102和vif37靶點(diǎn)的miRNA串聯(lián)單元以不同的組合和順序連接成為不同的3靶點(diǎn)miRNA結(jié)構(gòu),通過抑制效率評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)篩選獲得了一組具有良好3靶點(diǎn)抑制效果的簇狀

11、miRNA組合結(jié)構(gòu)(tri-miRNA),其對(duì)HIV-1的抑制效果優(yōu)于單個(gè)的miRNA元件,并可以有效抑制逃逸突變的產(chǎn)生。在脫靶效應(yīng)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,tri-miRNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞的增殖,不會(huì)干擾內(nèi)源性的天然miRNA的加工、成熟,也不會(huì)引發(fā)干擾素免疫反應(yīng),沒有檢測(cè)到明顯的細(xì)胞毒性。為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的多靶點(diǎn)簇狀miRNA構(gòu)建方法的適用性,進(jìn)一步在tri-miRNA的下游添加了兩個(gè)miRNA串聯(lián)單元,得到含有5個(gè)miRNA的

12、簇狀miRNA組合結(jié)構(gòu)(quin-miRaNA),其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)依次為po11402、vif37、po11102、po11217和po11026。Quin-miRNA中有4個(gè)miRNA在熒光素酶共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抑制效果,在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)沒有檢測(cè)到可見的副作用,可以高效抑制病毒的復(fù)制。本研究探索建立了構(gòu)建高效靶向HIV-1的多靶點(diǎn)RNAi元件的構(gòu)建策略,獲得了一批高效的RNAi靶點(diǎn)和具有較好應(yīng)用潛力的多靶點(diǎn)RNAi元件,為進(jìn)一步以R