以HIV-1 gp41為靶點(diǎn)的融合抑制劑活性評(píng)價(jià)和篩選方法研究.pdf

1、HIV-1融合抑制劑是以HIV-1包膜蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的抗HIV-1病毒藥物,通過(guò)抑制病毒與人體靶細(xì)胞融合來(lái)阻止病毒感染。多肽融合抑制劑T20(Fuzeon,Enfuvirtide)是第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市并應(yīng)用于臨床的HIV-1融合抑制劑。但由于T20藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,對(duì)HIV-1耐藥株產(chǎn)生耐藥性、成本高等缺點(diǎn),因此尋找藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,抗耐藥,成本低的藥物是開(kāi)發(fā)新的HIV-1融合抑制劑的主要方向。而發(fā)現(xiàn)有潛力的融合抑制劑則需

2、要以準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的測(cè)試方法為支撐。因此,本文以基于熒光素酶報(bào)告基因的細(xì)胞-細(xì)胞融合方法及熒光共振能轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的生化檢測(cè)方法分別從細(xì)胞水平及分子水平對(duì)HIV-1融合抑制劑的活性篩選及作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)試方法已成為HIV-1融合抑制劑活性評(píng)價(jià)的重要手段。此方法可較高程度上模擬病毒感染靶細(xì)胞的過(guò)程,具有安全、可定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。本課題組采用TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞兩種貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)試。通過(guò)

3、化學(xué)發(fā)光法對(duì)細(xì)胞融合后產(chǎn)生的熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)從而對(duì)細(xì)胞融合進(jìn)行定量測(cè)定。本文利用此方法對(duì)螺旋穩(wěn)定性多肽、FRET工具肽、共價(jià)型多肽融合抑制劑及表面活性劑系列HIV-1融合抑制劑進(jìn)行了活性評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)采用C34和T20進(jìn)行對(duì)照,篩選出數(shù)個(gè)具有低納摩爾活性的融合抑制劑。數(shù)據(jù)表明本方法具有可重復(fù)性,對(duì)融合敏感的特點(diǎn)。此外,本文還對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　熒光共振能轉(zhuǎn)移方法從分子水平進(jìn)行融合抑制劑的活性篩選及機(jī)制研究,該方法具有簡(jiǎn)便,重復(fù)

4、性好,測(cè)定周期短,可高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞融合測(cè)試方法的多靶點(diǎn)檢測(cè),熒光共振能轉(zhuǎn)移方法以特定靶點(diǎn)為檢測(cè)目標(biāo),驗(yàn)證抑制劑的作用靶點(diǎn)從而確定其作用機(jī)制。本課題組以含有g(shù)p41 NHR口袋形成區(qū)的多肽為靶點(diǎn),以連有熒光基團(tuán)與靶點(diǎn)肽匹配的C多肽為探針,加入抑制劑將探針競(jìng)爭(zhēng)性替換,通過(guò)熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行定量檢測(cè)。本文應(yīng)用此方法對(duì)以gp41 NHR口袋形成區(qū)為靶點(diǎn)的兩個(gè)多肽系列進(jìn)行了檢測(cè),得到了多肽抑制膜融合的兩種作用機(jī)制,即:與gp41