HIV-1單克隆中和抗體Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究.pdf

1、為實現(xiàn)預(yù)防、治療和治愈艾滋病的目標(biāo)，近二十年來基于HIV-1中和抗體的研究成為熱點。這些HIV中和抗體為通過技術(shù)手段在艾滋病感染者血液中分離、鑒定和改造的具有廣譜中和活性的抗體，HIV中和抗體在疫苗設(shè)計和免疫治療艾滋病感染者中發(fā)揮重要作用。
　　目前為止，中國已發(fā)現(xiàn)了A、B'、B、C、CRF_D2(CRF07_BC/CRF08_BC)、CRF01_ AE、CRF02_AG7種亞型的HIV病毒，其中HIV B/C、A/E重組亞型毒株

2、已成為中國主要的流行毒株。
　　本論文以中國流行株B/C亞型病人為研究對象，在前期篩選到Y(jié)498Fab抗體的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對該抗體的抗病毒活性和機(jī)制進(jìn)行了研究。在前期大規(guī)模篩選人源單克隆抗體的基礎(chǔ)上，我們首先表達(dá)純化了Y498Fab形式的抗體，通過活性檢測實驗證實抗體Y498Fab具有交叉反應(yīng)活性和中和活性，之后成功構(gòu)建了全分子Y498(Y498IgG)抗體，進(jìn)行活性檢測，發(fā)現(xiàn)Y498對HIV-1 B、C、B/C多種亞型抗原具有交

3、叉反應(yīng)活性，同樣對指示毒株NL4-3和SF162具有中和活性，SPR實驗證實了Y498抗體與JRFL抗原有著非常強(qiáng)的親和力，KD值為0.86nM，均高于b12(1.11nM)和VRC01(5.35nM);與CN54抗原同樣有著非常強(qiáng)的親和力，KD值為0.46nM，均高于b12(13.28nM)和VRC01(25.29nM)。而針對被檢測的八個業(yè)型81株假病毒中，Y498能夠有效中和高達(dá)26％(21/81)的假病毒株，在81株假病毒中，有

4、43株中國株，Y498能夠中和其中的12株，占28％，而在所有被檢測的B/C亞型中國株中，Y498的中和能力達(dá)到32％，且Y498對部分假病毒株中和能力強(qiáng)于b12和VRC01。提示該抗體具有一定的廣譜中和活性。
　　我們進(jìn)一步對Y498的抗病毒機(jī)制做了研究。實驗證實了Y498抗體與b12抗體一樣，識別HIV-1包膜刺突上gp120的構(gòu)象表位，隨后的競爭實驗發(fā)現(xiàn)其識別gp120上的CD4結(jié)合區(qū)，并與b12和VRC01競爭結(jié)合。生物信

5、息學(xué)分析預(yù)測Y498抗體所識別的表位，聯(lián)合篩選噬菌體隨機(jī)展示文庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者共有15個氨基酸位點重疊，我們以噬菌體12肽隨機(jī)展示文庫篩選到的6條肽段為基礎(chǔ)，利用Pepitope service軟件對Y498所識別的表位進(jìn)行預(yù)測，共得到24個可能的表位氨基酸殘基，對這些位點進(jìn)一步定點突變進(jìn)行活性檢測，發(fā)現(xiàn)有4個重要的氨基酸位點影響了Y498抗體的結(jié)合活性，分別為F277，D279，D368，E370，該4個位點均位于gp120的CD4結(jié)

6、合區(qū)內(nèi)，隨后的針對突變株中和實驗發(fā)現(xiàn)，有2個氨基酸位點影響了該抗體的中和能力，分別為D368，E370，并且它們同時影響了Y498抗體的結(jié)合活性和中和活性，據(jù)此認(rèn)為D368和E370為Y498抗體識別表位的關(guān)鍵位點。將這些Y498抗體表位相關(guān)的氨基酸位點與VRC01和b12相比較，發(fā)現(xiàn)D279為VRC01的關(guān)鍵位點，D368和E370為b12的關(guān)鍵位點，該結(jié)果與Y498分別競爭VRC01和b12相吻合。少數(shù)情況下，突變導(dǎo)致了中和活性的提

7、高，推測主要由于單個氨基酸突變不足以破壞高親和力抗體結(jié)合配體，這種情況同時印證了VRC01的類似中和機(jī)制。結(jié)合CD4在gp120上的結(jié)合位點分布，利用PyMOL軟件將Y498抗體所識別的表位氨基酸進(jìn)行展示，發(fā)現(xiàn)該四個位點位于CD4結(jié)合區(qū)的loop D區(qū)(F277, D279), CD4 binding Loop區(qū)(D368, E370)。
　　綜合針對Y498的抗病毒活性和機(jī)制研究，我們得出結(jié)論:Y498抗體對HIV-1不同亞型抗