中國流行HIV-1對抗病毒藥物的敏感性及病毒基因多態(tài)性研究.pdf

1、目的與意義:目前國際上將HIV-1分為M組、N組和O組三個組,M組又包括9種亞型和49種重組流行株(Circulating Recombinant Forms,CRFs),而且HIv的流行重組型還在不斷增多。中國是一個HIV流行形勢復雜的國家,包括B、B'(Thai-B)、C、F、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF02_AG等多種HIV亞型和重組型,而且這些亞型或重組型毒株之間再重組導致產(chǎn)生了01B、01C和C

2、RF0708等毒株。HIV-1 CRF07_BC、CRF01_AE和B'亞型是我國HIV—1主要流行的三種亞型毒株,大多感染這三種亞型的艾滋病患者分別通過靜脈吸毒,性傳播途徑和既往靜脈獻血而感染艾滋病。
　　 高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(Highly Active Antiretrovival Therapy,HAART)是目前最有效的抗HIV治療方法。HIV/AIDS病人在有效的抗病毒治療下,其平均生存期能延長數(shù)十年,艾滋病已成

3、為一種像高血壓、糖尿病這些不能根治但可以長期控制的慢性疾病。但HAART不能徹底清除感染者體內(nèi)的艾滋病病毒,需終身用藥,由此而帶來的藥物不良反應(yīng),依從性,病毒耐藥性產(chǎn)生,耐藥病毒株的傳播以及經(jīng)濟負擔等問題,成為了HAART面臨的主要問題和抗病毒治療失敗的主要原因。我國的HAART開始于1999年底,但較多病人接受治療始于2002年底,而且主要是基于國家免費治療藥物。到目前為止,全國已有10萬多HIV/AIDS病人接受了HAART。盡管我

4、國所用的藥物多以國產(chǎn)仿制藥為主,但與抗病毒治療前相比,艾滋病患者的病死率已明顯下降。
　　 我國抗病毒治療藥物組方,多為一種或兩種核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和一種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用,如Zidovudine+Didanosine+Nevirapine,Stavudine+Lamivudine+Nevirapine和Lamivudine+Zidovudine+Nevirapine的組合。自2003年我國實行免費抗病毒治療以來

5、,已有大量關(guān)于耐藥基因的產(chǎn)生而導致抗病毒治療失敗的報道。研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療失敗的病人經(jīng)病毒基因型耐藥監(jiān)測發(fā)現(xiàn)至少有一個或更多對逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥相關(guān)點耐藥位點和交叉耐藥情況,且表型耐藥情況的結(jié)果與基因型耐藥有較高的一致性。
　　 本文通過進一步研究不同亞型HIV-1臨床株對藥物的敏感性與病毒基因天然存在的多態(tài)性的關(guān)系,可以從基因水平闡明毒株逃逸藥物壓力而產(chǎn)生藥物耐受和適應(yīng)性機制。迄今,我國從未有過關(guān)于臨床分離株對HIV-1進入抑

6、制劑和蛋白酶抑制劑的基線敏感性的報道。作為優(yōu)化抗病毒組方,提高抗病毒治療效果的潛在替代藥物,也很有必要對其基線敏感性及其和病毒基因存在的天然多態(tài)性的關(guān)系進行研究。本文選擇分別來自新疆,北京和安徽三個不同流行地區(qū)的三種不同亞型HIV-1毒株,進行其對進入抑制劑,逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的基線敏感性研究及其與病毒基因多態(tài)性的關(guān)系分析。了解HIV-1臨床株對抗病毒藥物的基線敏感性對抗病毒藥物治療中藥物的正確選擇和初始治療時抗病毒藥物的劑量

7、選擇都有重要的理論指導意義。
　　 方法和結(jié)果:本研究中HIV-1CRF07_BC和B'亞型毒株來自2003年至2005年納入的中國區(qū)AIDS多中心研究的艾滋病感染人群,分別為新疆靜脈吸毒感染者和安徽既往獻血感染人群。HIV-1CRF01_AE毒株來自北京地區(qū)經(jīng)性傳播途徑感染的患者,于2006年至2008年納入AIDS多中心研究。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理認證委員會認可(IRB00002276),在收集患者血液樣本前所有納入研究的病人均簽

8、署了知情同意書。
　　 排除經(jīng)抗病毒治療后的人群中分離出來的病毒后,僅有14株病毒納入我們的研究,其中11例男性感染者和3例女性患者,平均年齡為37.6歲(27—52)。這14例病人通過三種不同的傳播途徑而感染HIV-1,其中5例為來自安徽的既往靜脈獻血人群(Former plamsa donors,FPDs),5例來自新疆的靜脈吸毒人群(Injection drug risers,IDUs)和4個來自北京的性傳播途徑感染者(S

9、exual transmitted infections,STIs)。入選病人的平均病毒載量為5.14±0.97log拷貝/mL(4-6.2),平均CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞計數(shù)分別為415±185個/μl(75-628)和1090±419個/μl(352-1955)。
　　 將成功分離的病毒感染HIV-1陰性PBMCs后擴大培養(yǎng),用表達CCR5和(或)CXCR4的GHOST細胞系(GHOST-CCR5,GHOST-

10、CXCR4和GHOST-R5/X4)測定臨床分離HIV-1病毒株的輔助受體利用情況。結(jié)果表明來自新疆的5株CRF07 BC重組病毒株和來自北京的4株CRF01_AE重組臨床分離株為R5嗜性,利用CCR5輔助受體進入靶細胞；來自安徽的5株B'亞型HIV-1臨床分離毒株中,3株為R5嗜性,僅利用CCR5輔助受體；另外2株(020100104、020100311)為R5/X4雙細胞嗜性,能同時利用CCR5輔助受體和CXCR4輔助受體進入靶細胞

11、。根據(jù)血漿中病毒核酸擴增的env和gag序列將HIV-1感染者分為CRF07_BC、CRF01_AE和B'亞型。從感染者PBMCs分離得到的臨床分離毒株中擴增病毒得到的Gp160核苷酸序列,進行系統(tǒng)進化樹分析再次進行亞型確認,與前面亞型分析結(jié)果一致。
　　 用藥物對HIV—1病毒感染TZM-b1細胞的抑制效率來評價病毒對進入抑制劑的敏感性。首先在TZM-b1細胞上滴定病毒,以100TCID50/孔的病毒量進行藥物抑制實驗。在不同

12、藥物濃度下,用HIV-1感染TZM-b1細胞,通過檢測化學發(fā)光值來計算藥物對病毒的50％抑制效率(IC50)。三種亞型所有毒株對enfuvirtide、C34、TAK779和maraviroc都很敏感。經(jīng)Student's t檢驗(正態(tài)分布且方差齊),或Mann-Whithney非參數(shù)檢驗(非正態(tài)分布或方差不齊),三種亞型分離株毒株對C34敏感性沒有統(tǒng)計學差異,CRF07_BC亞型毒株CRF01 AE或B'亞型毒株對enfuvirtid

13、e的敏感性,B'亞型毒株與CRF07_BC亞型毒株或CRF01_AE亞型毒株對TAK779和maraviroc有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同一亞型不同毒株對同一種藥物的敏感性有一定的差異,可能與病毒滴定及藥物敏感性檢測實驗過程中的隨機誤差,同一亞型不同毒株的基因分化及病毒的基因多態(tài)性,和實驗樣本量相對較少有關(guān)系。但是輔助受體CXCR4拮抗劑劑AMD3100在5μM的濃度下對所有實驗的毒株均無抑制活性,包括2株雙嗜性毒株(X4/R

14、5)在內(nèi),提示我們研究的2株雙嗜性毒株以利用CCR5為主。
　　 從病毒培養(yǎng)上清中提取病毒RNA,擴增其HIV-1包膜蛋白Gp120和Gp41核苷酸序列,與參考株HXB2相應(yīng)的序列進行對比,對病毒天然存在的與進入抑制劑敏感性相關(guān)的多態(tài)性位點進行了分析。所有的毒株在NHR GIV區(qū)域均無enfuvirtide相關(guān)耐藥位點出現(xiàn),在553氨基酸位點所有的重組病毒株均為N553S,在大部分B'亞型毒株上為N553R。所研究的14例毒株在

15、580氨基酸位點的Ⅰ均被Ⅴ所替代。僅在CRF07 BC毒株上發(fā)現(xiàn)A578T和V5831這兩個多態(tài)性位點。T20為衍生于CHR區(qū)域(638-673)的多肽,我們發(fā)現(xiàn)在這段區(qū)域內(nèi),存在較多的多態(tài)性位點640、641、643、644、646和658,且氨基酸替換形式較復雜,如S640N/D/R/K、L641T/Q/K/E/V和S644R/M/W/E/D等。CRF07_BC亞型毒株Gp120 V3區(qū)氨基酸比CRF01_AE和B'亞型毒株變異性更

16、大。多態(tài)性位點R306S、R311I、R315Q、V318Y、T319A、I320T、K323I、N326D和M317I在大部分CRF07_BC分離株中出現(xiàn),而N300S和K305T僅在所有CRF01_AE毒株中存在。在所有CRF07_BC和CRF01_AE重組毒株中發(fā)現(xiàn)的R315Q、A316TN和T319A,也可能是與輔助受體抑制劑敏感性相關(guān)的多態(tài)性位點。
　　 糖基化修飾對Env蛋白的免疫和生物學活性很重要,我們對病毒包膜蛋

17、白的糖基化位點也進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HIV-1 B'亞型,CRF01_AE和CRF07_BC三種亞型Gp120蛋白糖基化位點沒有明顯差異性,其平均值分別為25、25.6和26.2。B'亞型毒株Gp41區(qū)域糖基化位點平均數(shù)目為5.2個,與CRF01_AE和CRF07_BC相比,具有明顯的差異性(P<0.05)。
　　 本研究以假病毒系統(tǒng)為藥物敏感性檢測模型,研究了我國流行的主要HIV—1亞型毒株CRF07_BC包膜蛋白存在的天然

18、多態(tài)性位點與病毒對進入抑制劑的敏感性的關(guān)系。CH110為來源于中國地區(qū)HIV-1流行亞型毒株CRF07_BC的env基因質(zhì)粒,以此為模板,分別在Gp120和Gp41上引入突變位點:K305R、Q315E、Q315R、T316A、F317W、A319T、A319R和Q328K；V518M、T578A、1583V、Q630E、A662E和S665K。將鑒定為含目的突變基因的陽性克隆質(zhì)粒與HIV-1包膜蛋白缺失的骨架質(zhì)粒pSG3△env共轉(zhuǎn)染

19、,包裝出假病毒顆粒。在不同藥物濃度下,檢測突變前后的假病毒顆粒對進入抑制劑的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),我們所設(shè)計的12個位點引入突變氨基酸后的假病毒對enfuvirtide及兩個CCR5輔助受體抑制劑TAK779和maraviroc仍然具有很強的敏感性。將Gp120 V3區(qū)315位點的Q(谷氨酰胺)突變R(精氨酸)或E(谷氨酸)后,假病毒對enfuvirtide、TAK779和maraviroc的敏感性增強,尤其是Q突變成R后,對enfuvir

20、tide的敏感性增加了約19倍。其它位點引入突變基因后,假病毒對進入抑制劑敏感性變化均不明顯。
　　 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑是我國HIV-1抗病毒治療組方中主要兩大類藥物。我們將分離的病毒也進行了對RTIs和PIs基線敏感性檢測?；赥ZM-b1細胞的藥物敏感性檢測原理,Tat激活的螢光素酶蛋白表達在逆轉(zhuǎn)錄酶作用之后,蛋白酶作用之前,所以此體系適用于HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑敏感性檢測。利用傳統(tǒng)的感染PBMC的表型檢測方法進行了

21、蛋白酶抑制劑抑制活性檢測。結(jié)果顯示,三種亞型HIV-1毒株對3種RTIs(ddI、NVP和TMC-125)及2種PIs(APT和RTV)都有很強的敏感性。經(jīng)GraphPad Prism Software5.0軟件分析結(jié)果顯示,CRF07 BC和B'亞型毒株對ddI,TMC-125,APT和RTV的敏感性沒有統(tǒng)計學差異,對NVP(P<0.05)有統(tǒng)計學差異。由于CRF01_AE毒株樣本量相對偏少,未將其與CRF07_BC和B'亞型毒株作統(tǒng)

22、計學比較。但檢測的3株CRF01_AE重組毒株對非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑NVP和TMC-125均有很強的敏感性,約是B'和CRF07_BC毒株的4-5倍,但對非肽類蛋白酶抑制劑反應(yīng)性比B'和CRF07_BC毒株低。
　　 隨后,本研究對擴增的HIV-1 pol基因序列也進行了分析,結(jié)果顯示三種不同亞型毒株在pol基因區(qū)均無逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑相關(guān)耐藥位點存在,僅在個別毒株020100968和CYM033上發(fā)現(xiàn)蛋白酶耐藥次要

23、相關(guān)位點A71T和L10I,020100104上存在與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥次要相關(guān)突變位點M41N,在020100096和XJDC6331上分別發(fā)現(xiàn)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥次要相關(guān)突變位點V106I、E138A和E138A,但這些突變位點均未引起藥物敏感性發(fā)生變化。通過對蛋白酶基因區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),在所有CRF01_AE和CRF07_BC重組毒株中發(fā)現(xiàn)R41K位點,CRF07 BC重組和B'亞型共同存在L63P,193L這兩個多態(tài)性

24、位點。CRF01_AE上有一些特異性氨基酸替換:M36I、H69K和L89M。5株B啞型在RT區(qū)存在的特異性多態(tài)性位點:Q278E、Q334L、T400A和V435E。5株CRF07_BC在RT區(qū)存在多態(tài)性位點:S48T、V60I、R356K、G359T、T377M和E404D。3株CRF01_AE毒株上存在更多共同的的多態(tài)性位點:E6D、K11T、E40R、K43E、D123S、D177E、I178M、E203D、Q207A、R21S

25、、D237R、R276K、E312T、V317T、1329V、M357K、G359S、A371V和K388R。
　　 結(jié)論:本實驗結(jié)果表明中國流行的HIV-1不同亞型毒株對HIV進入抑制劑,逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的敏感性均表現(xiàn)出一定程度的差異,并且其中一些差異與不同亞型毒株間的基因多態(tài)性相關(guān)。此研究為感染不同亞型的HIV患者進行合理的治療方案設(shè)計提供了重要的理論指導。并對抗病毒藥物治療中藥物的正確選擇和初始治療時抗病毒藥物