恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1適應(yīng)性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究.pdf

1、自然界中，病毒與宿主間存在協(xié)同進(jìn)化的現(xiàn)象。一方面，宿主不斷進(jìn)化出防御機(jī)制來(lái)抑制病毒入侵、復(fù)制等，另一方面，病毒針對(duì)宿主的防御機(jī)制也進(jìn)化出獨(dú)特的機(jī)能來(lái)規(guī)避宿主對(duì)它的抑制。協(xié)同進(jìn)化不僅促進(jìn)了兩個(gè)相互作用物種之間的適應(yīng)性，增加了生物的多樣性，同時(shí)也對(duì)病毒跨物種傳播帶來(lái)了很大阻礙。在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的研究中發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞天然存在先天免疫因子，對(duì)病毒的侵入、復(fù)制和出芽存在限制作用。

2、這些因子被稱為“宿主限制因子”，參與先天性免疫反應(yīng)，干擾病毒生命周期的不同階段，達(dá)到對(duì)病毒的限制作用。目前已發(fā)現(xiàn)的限制因子有:APOBEC3 G(apolipoprotein BmRNAediting enzyme3G)、Trim5α(tripartite motif protein5α)、Tetherin(也被稱做CD317或HM1.24)、SAMHD1(sterileα motif domain and HD domain-cont

3、ainingprotein1)。這些限制因子可有效地限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，是宿主抵抗病毒感染的一個(gè)重要防御屏障。Tetherin是一種具有特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的脂筏相關(guān)跨膜蛋白，它可通過(guò)連接病毒和宿主細(xì)胞膜，將新出芽的病毒束縛在細(xì)胞膜表面，從而限制病毒釋放[。
　　在恒河猴免疫缺陷病毒(SIV)/恒河猴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究中，人們同樣發(fā)現(xiàn)了恒河猴細(xì)胞內(nèi)也存在Tetherin蛋白來(lái)抑制SIV在恒河猴體內(nèi)的擴(kuò)散。而且恒河猴的Tetherin基因

4、具有一定多態(tài)性，但是對(duì)于恒河猴Tetherin基因多態(tài)性及其多態(tài)性對(duì)自身蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響并沒(méi)有明確報(bào)道。另一方面，Tetherin作為一種天然抗病毒蛋白，在不同的物種中，它的蛋白結(jié)構(gòu)也有所不同，具有物種特異性。如果能使HIV跨過(guò)恒河猴Tetherin蛋白的限制作用，這可以成為對(duì)AIDS動(dòng)物模型優(yōu)化的重要一步。
　　方法:本研究通過(guò)基因測(cè)序、序列比對(duì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等技術(shù)，探尋恒河猴tetherm基因位置上可能影響其蛋白功能的c

5、SNP位點(diǎn)，再把不同基因型的tetherin插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建不同基因型的tetherin表達(dá)載體。用不同基因型的tetherin表達(dá)載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SIV的病毒載量，以及流式檢測(cè)Tetherin基因在細(xì)胞表面的表達(dá)情況，最后對(duì)恒河猴進(jìn)行基因型的分類，比較不同基因型SIV感染恒河猴之間的病毒復(fù)制情況。另一方面，構(gòu)建表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL細(xì)胞系，通過(guò)

6、HIV-1NL4-3在表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL與不表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL的混合細(xì)胞中培養(yǎng)，在體外模擬自然進(jìn)化，最終使得HIV-1NL4-3能夠產(chǎn)生適應(yīng)性毒株，感染表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL，實(shí)現(xiàn)HIV-1NL4-3對(duì)恒河猴Tetherin限制作用的跨越。
　　結(jié)果:序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)8個(gè)非同義突變位點(diǎn);用Psipred軟件預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其中G41A、T128C、C129和A33

7、3C這四個(gè)cSNP位點(diǎn)會(huì)使Tetherin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在各基因型恒河猴tetherin表達(dá)載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染不同tetherin表達(dá)載體的293T細(xì)胞表達(dá)SIV病毒的載量之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是不同基因型恒河猴的tetherin基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Tetherin蛋白表達(dá)有所不同，GLQ和GPH型的恒河猴Tetherin蛋白表達(dá)要顯著高于DLQ和DPH型。在對(duì)不同基因型恒河猴的SIVmac23

8、9后病毒復(fù)制峰值和病毒復(fù)制控制值的比較中，發(fā)現(xiàn)DLQ基因型恒河猴病毒復(fù)制水平要高于GLQ型恒河猴(p＜0.05)，其他基因型恒河猴的感染值之間沒(méi)有顯著差異。
　　成功構(gòu)建表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL后，通過(guò)HIVNL4-3分別在表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中和不表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，比較兩種細(xì)胞感染之間的病毒蛋白P24濃度以及活力，發(fā)現(xiàn)不同組別之間病毒P24濃度沒(méi)有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:在中國(guó)恒河猴的tetherin基因中，我們發(fā)現(xiàn)了9個(gè)cSNP位點(diǎn)，其中有四個(gè)cSNP位點(diǎn)(G41A、T128C、C129和A333C)可影響Tetherin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和恒河猴體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，恒河猴Tetherin基因的cSNP并沒(méi)有影響其抗病毒作用，但卻可以影響SIV對(duì)其拮抗作用。在HIVNL4-3對(duì)表達(dá)恒河猴Tetherin的TZM-BL的適應(yīng)性培養(yǎng)中，我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)恒河猴Tether