A型流感病毒單鏈抗體基因的克隆及抗病毒活性研究.pdf

1、單鏈抗體(single-chain antibody fragment，ScFv)是基因工程方法制各的小分子抗體，由彈性連接肽將抗體的重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接而成的重組抗體。其不含有抗體分子的恒定區(qū)片段，因而免疫原性弱，使抗體的作用更集中于靶細(xì)胞部位，實體組織穿透力強(qiáng)，血漿半衰期短等，在臨床診斷及治療中具有重要的應(yīng)用價值。
　　本研究選擇豬流感病毒A/Swine/Guangdong/2004(H1N1)和禽流感病毒A/Goose

2、/Guangdong/1/96(H5N1)毒株分別作為抗H1亞型和H5亞型單抗制備的免疫原，將其HA基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX1中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVAX1-HA1和pVAX1-HA5。使用純化的pVAX1-HA1、pVAX1-HA5和全病毒滅活抗原H1N1、H5N1分別免疫5周齡Balb/c小鼠，通過純化的病毒GD/04(H1N1)和GD/1/96(H5N1)作為ELISA反應(yīng)的包被抗原，篩選出陽性克隆。經(jīng)過四輪亞克隆，共獲得12株

3、抗H1N1流感病毒的單抗和23株抗H5N1流感病毒的單抗。然后，對ELISA實驗為陽性的樣本再進(jìn)行中和實驗篩選，最終得到4株ELISA反應(yīng)為強(qiáng)陽性，并且具有中和活性的抗H1N1的細(xì)胞克隆，分別命名為8H1、4D5、5C6和5C3;4株抗H5N1的細(xì)胞克隆，分別命名為3F2、7H5、3D6和3F9。
　　分別提取8株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用兼并性引物克隆得到單克隆抗體的輕、重鏈基因，并進(jìn)行測序。

4、通過在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列分析比對確定后，應(yīng)用SOE-PCR方法，將輕鏈和重鏈基因通過一條連接肽連接，得到完整的單鏈抗體基因。將ScFv基因插入到pCDNA-3.1載體中，構(gòu)建了pCDNA-ScFv真核表達(dá)系統(tǒng)。
　　將pCDNA-ScFv轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，用病毒滴定、熒光定量PCR、高內(nèi)涵成像系統(tǒng)研究了抗流感病毒復(fù)制的活性。結(jié)果表明:單鏈抗體8H1和4D5可以明顯的抑制H1N1流感病毒的復(fù)制，并能抑制病毒傳播。單鏈抗體5C6和