全反式維甲酸介導(dǎo)依賴p38MAPK的SRC-3磷酸化及RARα信號(hào)通路影響大腦皮層神經(jīng)元RARα轉(zhuǎn)錄激活活性.pdf

1、目的 在全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)的作用下，研究小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞p38MAPK、SRC-3的磷酸化改變以及SRC-3的降解與RARα的轉(zhuǎn)錄激活活性之間的關(guān)系。 方法 取16天正常孕鼠胚胎進(jìn)行大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞的剝離并利用NEOCORTICAL CELLDISSECTION的培養(yǎng)方法進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80％左右時(shí)： 1.用ATRA干

2、預(yù)細(xì)胞不同時(shí)間后，利用Western-immunoblotting檢測(cè)p38MAPK和SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白總量；利用凝膠滯留電泳(ElectrophoreticMobility Shift Assay，EMSA)技術(shù)檢測(cè)RARα的轉(zhuǎn)錄激活活性；采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HOXd3基因表達(dá)情況； 2.選取關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)16h，同時(shí)給予ATRA和泛素-蛋白酶體抑制劑MG 132干預(yù)細(xì)胞，利用Weste

3、rn-immunoblotting檢測(cè)SRC-3的蛋白總量； 3.選取關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)16h，同時(shí)給予ATRA和p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)細(xì)胞，利用Western-immunoblotting檢測(cè)SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白總量；利用EMSA檢測(cè)RARα的轉(zhuǎn)錄激活活性；采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HOXd3基因表達(dá)情況； 4.選取關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)16h，同時(shí)給予ATRA和ERK(p42/44)

4、MAPK抑制劑PD98059干預(yù)細(xì)胞，利用Western-immunoblotting檢測(cè)SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3的蛋白總量。 結(jié)論 1.ATRA引起了神經(jīng)元細(xì)胞p38MAPK和SRC-3的磷酸化，而且，SRC-3的磷酸化依賴于p38MAPK途徑； 2.ATRA作用于神經(jīng)元細(xì)胞后，SRC-3磷酸化后成為泛素.蛋白酶體的作用靶標(biāo)，被泛素-蛋白酶體識(shí)別并降解；SRC-3的降解依賴于p38MAPK途徑；